Бактериофаг от поноса


Пиобактериофаг комплексный раствор - инструкция по применению, дозировки, аналоги, противопоказания

Клинико-фармакологическая группа

Антибактериальный препарат

Действующее вещество

- смесь стерильных фильтратов фаголизатов стафилококков, стрептококков, энтерококков, протея, клебсиелл (пневмонии и окситока), синегнойной и кишечной палочек

Форма выпуска, состав и упаковка

◊ Раствор для приема внутрь и местного применения 1 фл.
смесь стерильных фильтратов фаголизатов стафилококков, стрептококков, энтерококков, протея, клебсиелл (пневмонии и окситока), синегнойной и кишечной палочек 20 мл

Консервант: хинозол 0.0001 г/мл

20 мл - флаконы (8) - пачки картонные.

◊ Раствор для приема внутрь и местного применения 1 фл.
смесь стерильных фильтратов фаголизатов стафилококков, стрептококков, энтерококков, протея, клебсиелл (пневмонии и окситока), синегнойной и кишечной палочек 100 мл

Консервант: хинозол 0.0001 г/мл

100 мл - флаконы (1) - пачки картонные.

Новости по теме

Фармакологическое действие

Пиобактериофаг комплексный жидкий обладает способностью специфически лизировать бактерии стафилококков, стрептококков, энтерококков, протея, клебсиелл пневмония и окситока, синегнойной и кишечной палочек.

Показания

Лечение и профилактика гнойно-воспалительных и кишечных заболеваний, вызванных стафилококками, энтерококками, стрептококками, синегнойной палочкой, клебсиеллами, патогенной кишечной палочкой различных серогрупп, протеем при внутреннем, ректальном и наружном применении:

  • заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких: воспаления пазух носа, среднего уха, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит;
  • хирургические инфекции: нагноения ран, ожоги, абсцесс, флегмона, фурункулы, карбункулы, гидроаденит, панариции, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит;
  • урогенитальные инфекции: уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит;
  • посттравматические конъюнктивиты, кератоконъюнктивиты, гнойные язвы роговицы и иридоциклиты;
  • энтеральные инфекции: гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз;
  • генерализованные септические заболевания;
  • гнойно-воспалительные заболевания новорожденных: омфалит, пиодермия, конъюнктивит, гастроэнтероколит, сепсис и др.;
  • другие заболевания, вызванные бактериями стафилококков, стрептококков, энтерококков, протея, клебсиелл пневмония и окситока, синегнойной и кишечной палочек.

С профилактической целью препарат используют для обработки операционных и свежеинфицированных ран, а также для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям.

Важным условием эффективной фаготерапии является предварительное определение фагочувствителыюсти возбудителя.

Противопоказания

Отсутствуют.

Дозировка

Лечение гнойно-воспалительных заболеваний с локализованными поражениями должно проводиться одновременно как местно, так и через рот, 7-20 дней (по клиническим показаниям).

В зависимости от характера очага инфекции бактериофаг применяют:

1. Местно в виде орошения, примочек и тампонирования жидким фагом в количестве до 200 мл в зависимости от размеров пораженного участка. При абсцессах бактериофаг вводят в полость очага после удаления гноя с помощью пункции. Количество вводимого препарата должно быть несколько меньше объема удаленного гноя. При остеомиелите после соответствующей хирургической обработки в рану вливают бактериофаг по 10-20 мл.

2. Введение в полости - плевральную, суставную и другие ограниченные полости до 100 мл бактериофага, после чего оставляют капиллярный дренаж, через который в течение нескольких дней повторно вводят бактериофаг.

3. При циститах, пиелонефритах, уретритах препарат принимают внутрь. В случае, если полость мочевого пузыря или почечной лоханки дренированы, бактериофаг вводят через цистостому или нефростому 1-2 раза в день по 20-50 мл в мочевой пузырь и по 5-7 мл в почечную лоханку.

4. При гнойно-воспалительных гинекологических заболеваниях препарат вводят в полость вагины, матки в дозе 5-10 мл ежедневно однократно.

5. При гнойно-воспалительных заболеваниях уха, горла, носа препарат вводят в дозе 2-10 мл 1-3 раза в день. Бактериофаг используют для полоскания, промывания, закапывания, введения смоченных турунд (оставляя их на 1 час).

6. При конъюнктивитах и кератоконъюнктивитах препарат закапывают по 2-3 капли 4-5 раз/сут, при гнойной язве роговицы - по 4-5 капель, при гнойных иридоциклитах препарат применяют по 6-8 капель каждые 3 ч в сочетании с приемом внутрь.

7. При лечении стоматитов и хронических генерализованных парадонтитов препарат используют в виде полосканий полости рта 3-4 раза в день в дозе 10-20 мл, а также введением в пародонтальные карманы турунд, пропитанных пиобактериофагом, на 5-10 минут.

8. При кишечных формах заболевания, заболеваниях внутренних органов, дисбактериозе бактериофаг применяют через рот и в клизме. Через рот бактериофаг дают 3 раза/сут натощак за 1 ч до еды. В виде клизм назначают 1 раз/сут вместо одного приема через рот.

Рекомендуемые дозировки препарата

Возраст Доза на 1 прием (в мл)
через рот в клизме
0-6 мес 5 10
6-12 мес 10 20
от 1 года до 3 лет 15 30
от 3 лет до 8 лет 20 40
от 8 лет и старше 30 50

Применение бактериофагов не исключает использования других антибактериальных препаратов. В случае, если до применения бактериофага для лечения ран применялись химические антисептики, рана должна быть тщательно промыта стерильным 0.9% раствором натрия хлорида.

Применение бактериофага у детей (до 6 месяцев). При сепсисе, энтероколите новорожденных, включая недоношенных детей, бактериофаг применяют в виде высоких клизм (через газоотводную трубку или катетер) 2-3 раза в сутки (см. табл.). При отсутствии рвоты и срыгивания возможно применение препарата через рот. В этом случае он смешивается с грудным молоком. Возможно сочетание ректального (в клизмах) и перорального (через рот) применения препарата. Курс лечения 5-15 дней. При рецидивирующем течении заболевания возможно проведение повторных курсов лечения. С целью профилактики сепсиса и энтероколита при внутриутробном инфицировании или опасности возникновения внутрибольничной инфекции у новорожденных детей бактериофаг применяют в виде клизм 2 раза в день в течение 5-7 дней.

При лечении омфалитов, пиодермии, инфицированных ран препарат применяют в виде аппликаций ежедневно двукратно (марлевую салфетку смачивают бактериофагом и накладывают на пупочную ранку или на пораженный участок кожи).

Побочные действия

Не установлено.

Передозировка

Меры по оказанию помощи при передозировке не установлены.

Лекарственное взаимодействие

Применение препарата возможно в сочетании с другими лекарственными средствами, в т.ч. с антибиотиками.

Особые указания

Перед употреблением флакон с жидким бактериофагом необходимо взбалтывать. При помутнении не употреблять!

Влияние на способность к вождению автотранспорта и управлению механизмами

Сведения о возможном влиянии лекарственного препарата на способность управлять транспортными средствами, механизмами отсутствуют.

Беременность и лактация

Возможно применение препарата при беременности и в период грудного вскармливания по показаниям.

Применение в детском возрасте

Применение возможно согласно режиму дозирования.

Применение в пожилом возрасте

Применение возможно согласно режиму дозирования.

Условия отпуска из аптек

Без рецепта.

Условия и сроки хранения

Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С в сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте. Замораживание не допускается. Срок годности - 2 года.

Транспортирование в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2° до 8°С, допускается транспортирование при температуре от 9° до 25°С не более 1 месяца. Замораживание не допускается.

Описание препарата Пиобактериофаг комплексный основано на официально утвержденной инструкции по применению и утверждено компанией–производителем.

Предоставленная информация о ценах на препараты не является предложением о продаже или покупке товара. Информация предназначена исключительно для сравнения цен в стационарных аптеках, осуществляющих деятельность в соответствии со статьей 55 ФЗ «Об обращении лекарственных средств».

Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.

границ | Адаптированные бактериофаги для лечения инфекций мочевыводящих путей

Введение

Возникновение и повторное возникновение множественных устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций и их быстрое распространение в окружающей среде привело к новому росту научного интереса к терапии бактериофагами как альтернативе антибиотикам. Использование бактериофагов для лечения бактериальных инфекций было предложено французско-канадским ученым Феликсом д’Эреллем в 1917 году. С тех пор бактериофаговая терапия применяется в различных областях медицины для лечения различных бактериальных инфекций (Chanishvili, 2012).Однако после открытия пенициллина в 1940-х годах западные научные общества отдали предпочтение терапии антибиотиками, в то время как многие врачи и исследователи в республиках бывшего Советского Союза оставались приверженцами терапии бактериофагами и продолжали использовать ее отдельно или в сочетании с антибиотиками (Чанишвили, 2012), дополнительные ссылки см. Также в Дополнительных материалах, частично на русском языке.

Симптомы нижних мочевыводящих путей (СНМП) - распространенная проблема у взрослых мужчин, оказывающая большое влияние на качество жизни (Martin et al., 2011). Традиционно СНМП были связаны с обструкцией выходного отверстия мочевого пузыря, которая часто вызывается увеличением простаты (Abrams et al., 2002). Увеличение предстательной железы встречается примерно у 25% мужчин в возрасте от 50 до 30% и у 50% мужчин в возрасте 80 лет и старше (Kupelian et al., 2006). Трансуретральная резекция простаты (ТУРП) считается краеугольным камнем хирургического лечения СНМП на фоне доброкачественной обструкции предстательной железы (Cornu et al., 2015). Эти пациенты имеют значительный риск инфекций мочевыводящих путей (ИМП) (Schneidewind et al., 2017). Помимо возможного образования остаточной мочи, которая действует как питательная среда для бактерий (Truzzi et al., 2008), многие из этих пациентов полагаются на краткосрочную или долгосрочную катетеризацию перед дальнейшим лечением. Однократное введение катетера вызывает инфекцию в 1–2% случаев, в то время как катетеры с открытыми дренажными системами вызывают бактериурию почти в 100% случаев в течение 3–4 дней (Warren, 1992; Bonkat et al., 2018).

Поэтому мы решили совместить ТУРП с терапией бактериофагами, используя бактериофаги в качестве замены периоперационных антибиотиков.Настоящее исследование было разработано как проспективное двухэтапное (первая фаза: адаптация бактериофага, вторая фаза: лечение коммерчески доступным, но адаптированным бактериофагом Pyo), предшествующее рандомизированному плацебо-контролируемому двойному слепому клиническому исследованию (Leitner et al. , 2017) для оценки эффективности и безопасности адаптированных бактериофагов для лечения (связанных с катетером) ИМП (Nicolle et al., 2005; Hooton et al., 2010; Bonkat et al., 2018) у пациентов, перенесших ТУРП.

Пациенты и методы

Утверждение комитета по этике

Это проспективное двухэтапное исследование было одобрено местным этическим комитетом (TNCU-02/283; Тбилиси, Грузия) и проводилось в Национальном центре урологии Александра Цулукидзе (TNCU), Тбилиси, Грузия, и в Институте бактериофага Элиава. , Микробиология и вирусология (EIBMV), Тбилиси, Грузия.Исследование было разработано как исследование, предшествующее рандомизированному контролируемому исследованию (РКИ), зарегистрированному на ClinicalTrials.gov: NCT03140085 (Leitner et al., 2017).

Пациенты

С сентября 2016 г. 130 пациентов, которым была запланирована ТУРП, были обследованы в рамках подготовки к РКИ (Leitner et al., 2017) в TNCU. На первом этапе оценивались посевы мочи от всех пациентов (взятых в середине потока мочи или из существующего трансуретрального или надлобкового катетера). В целом у 118 (91%) из 130 пациентов, прошедших скрининг, были положительные посевы мочи с заранее определенными уропатогенами (т.е., Staphylococcus aureus , E. coli , Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa , Proteus mirabilis ) и ≥10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. Выделенные культуры последовательно подвергали тесту in vitro на чувствительность бактериофага к коммерчески доступному и зарегистрированному в Грузии раствору бактериофага Pyo (Eliava BioPreparations Ltd., Тбилиси, Грузия), который подвергался циклам адаптации, как описано в следующем абзаце.На втором этапе девять пациентов, у которых была определена чувствительность к коктейлю, были дополнительно подвергнуты лечению бактериофагами без ослепления. Критерии исключения: симптоматические ИМП, микроорганизмы, нечувствительные к бактериофагу Pyo, и возраст до 18 лет. У всех пациентов перед операцией были собраны значения размера простаты, простатоспецифического антигена (PSA), международного балла симптомов простаты (IPSS) (Barry et al., 1992), максимальной скорости потока и остаточного количества жидкости после мочеиспускания. Был собран удаленный объем простаты и определены гистологические результаты.Забор посевов мочи повторяли через 7 дней после операции или во время каких-либо побочных эффектов. Письменное информированное согласие было получено от всех включенных пациентов.

Приготовление и адаптация бактериофагов

Чтобы охватить множество уропатогенов, для лечения ИМП был использован коммерческий препарат под названием бактериофаг Pyo, производимый компанией Eliava BioPreparations Ltd., Тбилиси, Грузия. Этот коктейль бактериофагов состоит из линий бактериофагов, активных против широкого спектра уропатогенных бактерий: Staphylococcus aureus, E.coli, Streptococcus spp. (включая стрептококки группы D, переименованные в настоящее время в Enterococcus spp.), Pseudomonas aeruginosa и Proteus spp. урологических инфекций (Чанишвили, 2012). Как это общепринято, коммерческие коктейли с бактериофагами, включая бактериофаг Pyo, регулярно адаптируются EIBMV с целью повышения эффективности коктейля бактериофагов в отношении вновь появляющихся патогенов (Kutter et al., 2010; Villarroel et al., 2017; McCallin и другие., 2018). Также в нашем исследовании мы применили адаптацию для повышения эффективности и охвата уропатогенных штаммов, которые изначально имели промежуточную или устойчивую оценку в исследовании чувствительности in vitro , аналогично тому, как это было сделано в ранее проведенном исследовании in vitro (Sybesma et al. ., 2016). Метод основан на протоколе Аппельмана для титрования бактериофагов (Appelmans, 1921) и отбирает h-мутанты с более широким и более сильным взаимодействием хозяин-бактериофаг (Merabishvili et al., 2018). Подобно определению минимальной ингибирующей концентрации для антибиотиков (Levison and Levison, 2009), метод Аппельманса основан на жидкостном титровании бактериофагов и определяет самую низкую концентрацию бактериофагов, которые проявляют оптическую прозрачность в течение 24–72 ч в суспензии с предварительно отобранные бактериальные штаммы, устойчивые к коктейлю бактериофагов. Это разведение с наименьшей концентрацией бактериофагов, точка отсечения, обозначается отрицательными значениями степени.Если исходный титр бактериофага был 10 -1 , он может стать 10 -2 или 10 -3 с каждым раундом разбавления, что указывает на то, что более активные единицы бактериофага были способны уничтожать бактерии и что тестируемые бактерии имели становятся менее устойчивыми к адаптированным бактериофагам.

Последующий титр бактериофагов определяется двумя методами: титрованием в жидкости (Appelmans, 1921) и титрованием с использованием метода двухслойного агара (Gratia, 1936).Титрование проводится для каждого компонента, входящего в состав бактериофагов Pyo, отдельно на стандартном наборе культур-хозяев (т. Е. Титр бактериофагов E. coli определяется на наборе стандартных штаммов E. coli , титр Компонент стафилококка определяется на наборе стандартных штаммов стафилококка и др.). Таким образом оценивается титр бактериофагов в диапазоне 10 7 –10 9 бляшкообразующих единиц на мл (БОЕ / мл).Однако титр отдельных (адаптированных) клонов, входящих в одну группу бактериофагов, может варьироваться (McCallin et al., 2018).

Микробиологическая оценка и тест на чувствительность к бактериофагам

На первом этапе образцы мочи наносили тройными штрихами на хромогенную среду Uriselect TM 4 (Bio-Rad Laboratories, Марн-ла-Кокетт, Франция) для количественного определения и квалификации уропатогенных микроорганизмов. Положительные посевы мочи оценивали под микроскопом на предмет окраски по Граму и морфологии.Для всех штаммов бактерий были проведены тесты на чувствительность к антибиотикам и фагам. Если были обнаружены подходящие микроорганизмы, потенциально поддающиеся лечению бактериофагом Pyo ( S. aureus , E. coli, Streptococcus spp., P. aeruginosa, P. mirabilis ), посевы мочи отправлялись в EIBMV для дальнейшего скрининга на бактериофаги. чувствительность. Для этого образцы мочи были повторно культивированы, и их идентичность была повторно проверена. Как только те же подходящие микроорганизмы были культивированы, был проведен скрининговый анализ лизиса бактериальных клеток, как описано ранее (Sybesma et al., 2016). Если результаты in vitro и показали четкий сливающийся лизис на чашке Петри с бактериальным газоном, он был классифицирован как чувствительный (рис. 1). В адаптационных циклах использовали устойчивые и среднеустойчивые штаммы. В случае чувствительности бактериофаг Пио был отправлен в больницу для начала лечения. Через семь дней после ТУРП снова собирали пробы мочи, трижды культивировали на вышеупомянутой хромогенной среде Uriselect TM 4 и повторно оценивали.

РИСУНОК 1. Различные степени лизиса бактериальной культуры за счет активности бактериофага. Результаты в верхней строке (для бактериофага Pyo и бактериофага Intesti) рассматриваются как «S» (чувствительные), а результаты в нижней строке (бактериофаг Ses и бактериофаг Enko) считаются как «I» (промежуточные). Примечание. Бактериофаги Pyo, Intesti, Ses и Enko являются коммерчески доступными коктейлями с бактериофагами. Фотография была сделана во время ранее проведенной работы (Sybesma et al., 2016), в которой использовалось несколько различных коктейлей с бактериофагами.

Внутрипузырное лечение бактериофагом

Трансуретральная резекция простаты была выполнена в соответствии с общей хирургической практикой с использованием монополярного резектоскопа (May and Hartung, 2006). Для орошения под низким давлением каждому пациенту был установлен надлобковый троакар. Периоперационная антибиотикопрофилактика не проводилась. После ТУРП были помещены надлобковый катетер и трансуретральный катетер для поддержания ирригации. Трансуретральный катетер был удален через 24–48 часов. Надлобковый катетер оставляли на месте в течение 7 дней, чтобы обеспечить возможность закапывания адаптированного бактериофага Pyo.Пио бактериофаг вводился лечащим врачом два раза в сутки (т. Е. 8.00, 20.00) в течение 7 дней, начиная с первого дня после операции. Раствор объемом 20 мл оставался в мочевом пузыре примерно 30–60 мин.

Оценка безопасности и клинических / микробиологических результатов

Все нежелательные явления на этапе лечения регистрировались в соответствии с рекомендациями Международной конференции по гармонизации (ICH) по надлежащей клинической практике (GCP) (E6) (Международная конференция по гармонизации, 1996 г.) и Международной организацией по стандартизации (ISO 14155) (Международная организация по стандартизации). Организация по стандартизации, 2011).Потенциальная эффективность оценивалась с использованием клинических / микробиологических параметров и определялась как отсутствие клинических признаков инфекции и снижение КОЕ / мл.

Параметры результата

Первичные: (а) чувствительность уропатогенных штаммов к коммерчески доступному, но адаптированному бактериофагу Pyo (первая фаза) и (b) эффект внутрипузырного лечения адаптированным бактериофагом Pyo (вторая фаза).

Вторичный: Возникновение / отсутствие нежелательных явлений в соответствии с категоризацией в соответствии с Общими критериями терминологии для нежелательных явлений Национального института рака (CTCAE) версии 4 от 1 до 5 степени во время лечения бактериофагом (вторая фаза).

Статистический анализ

Использовалась описательная статистика. Данные представлены в виде процентов или среднего ± стандартное отклонение. Из-за ограниченного числа субъектов дальнейший статистический анализ не проводился.

Результаты

Первая фаза: in vitro Циклы тестирования чувствительности к бактериофагам и адаптации

Распределение бактериальных штаммов у 118 включенных пациентов показано на рисунке 2. 24% и 17% всех штаммов были чувствительными и промежуточными по отношению к первоначально используемому бактериофагу Pyo (т.е.е., общая чувствительность 41%), Рисунок 3А. После четырех циклов адаптации чувствительность и промежуточная чувствительность увеличились до 41% и 34% (то есть общая чувствительность 75%), рис. 3В.

РИСУНОК 2. Пропорциональное распределение бактериальных штаммов. Посевы мочи 118 включенных пациентов показали следующее распределение бактериальных штаммов: E. coli был обнаружен преимущественно с 41%, затем Enterococcus spp. с 29%, Streptococcus spp.с 20%, Pseudomonas aeruginosa с 8%, Staphylococcus spp. 7%, Proteus spp. 4% и другие 9%.

РИСУНОК 3. Пропорциональное распределение чувствительных, промежуточных и устойчивых штаммов среди 118 клинических образцов до (A) и после (B) четырех циклов адаптации коктейля бактериофагов Pyo.

Вторая фаза: лечение адаптированным пиобактериофагом

Характеристики пациентов приведены в таблице 1.Средний возраст составил 69 ± 12 лет, анкеты IPSS выявили СНМП от умеренной до сильной (IPSS 20 ± 2). Средний размер простаты составил 77 ± 37 мл, все значения ПСА находились в пределах непатологического диапазона. Максимальная скорость потока составляла 11 ± 3 мл / с при среднем остатке после мочеиспускания 80 ± 100 мл. Двум пациентам перед операцией был установлен постоянный катетер. Среднее время операции 48 мин, осложнений при операции на простате не было. Гистологические результаты выявили доброкачественную гиперплазию предстательной железы во всех случаях, у пяти пациентов была обнаружена интраэпителиальная неоплазия предстательной железы высокой степени, но злокачественных заболеваний обнаружено не было.

ТАБЛИЦА 1. Обобщение результатов внутрипузырного лечения бактериофагом Pyo, проведенного у девяти пациентов.

До лечения посев мочи выявил E. coli у четырех, Streptococcus spp. в двух - Enterococcus spp. у двух и P. aeruginosa у одного из девяти пациентов. После лечения у четырех пациентов не наблюдалось значительного роста бактерий, тогда как у E. coli и Enterococcus spp.были по-прежнему изолированы из посевов мочи четырех и одного пациента, соответственно. У шести из девяти пациентов (67%) титры бактерий снизились после лечения бактериофагом (таблица 1).

Не было обнаружено никаких побочных эффектов, связанных с бактериофагами. У одного пациента лечение антибиотиками (цефалоспорин третьего поколения) было начато на 3-й день после развития лихорадки (> 38,0 ° C), и симптомы исчезли в течение 48 часов. Посев мочи показал P. aeruginosa.

Обсуждение

Анализ in vitro показал чувствительность уропатогенных бактерий к коммерчески доступному бактериофагу Pyo 41%.Циклы адаптации бактериофага Pyo дополнительно повысили его чувствительность до 75%. В нашей пилотной серии in vivo бактериальные титры снизились после лечения бактериофагом у шести из девяти пациентов (67%). Побочных эффектов, связанных с бактериофагами, не было обнаружено, но у одного пациента поднялась лихорадка из-за инфекции P. aeruginosa с восстановлением симптомов при лечении антибиотиками.

Наше исследование было разработано для оценки осуществимости, переносимости и безопасности, а также для оценки клинических / микробиологических результатов коммерчески доступных адаптированных бактериофагов Pyo перед плацебо-контролируемым двойным слепым РКИ (Leitner et al., 2017). Мы не исследовали состав постоянно адаптированного коктейля бактериофага Pyo, например, с помощью метагеномного анализа, как недавно описано для ранее использовавшихся коктейлей бактериофага Pyo (Villarroel et al., 2017; McCallin et al., 2018), где также сообщалось что в результате адаптации титр отдельных включенных клонов бактериофагов может изменяться. Мы ожидаем, что подробное разъяснение состава коктейлей с бактериофагами, а также понимание механизмов, лежащих в основе бактериофаговой инфекции или бактериальной устойчивости, станут более актуальными, как только будут описаны более убедительные результаты об эффективности бактериофаговой терапии.

Бактериофаготерапия уже десятилетиями практикуется в странах Восточной Европы (Чанишвили, 2012), и многие люди знают о ее существовании (дополнительные ссылки см. Также в Дополнительных материалах, частично на русском языке). В настоящем открытом новаторском исследовании плацебо-контролируемого двойного слепого РКИ коммерчески доступный препарат Pyo bacteriophage использовался для лечения девяти пациентов, которым была запланирована ТУРП и которым был поставлен диагноз ИМП. Терапия бактериофагом началась только после положительного результата анализа чувствительности in vitro изолированного уропатогена с коктейлем бактериофага Pyo и не вызвала каких-либо побочных эффектов, таких как повышение температуры тела, головная боль, гематурия или аллергическая реакция у восьми из девять пациентов.Только в одном случае (№9) на 3-и сутки после операции на простате наблюдалась лихорадка. После внезапного повышения температуры тела (38,5 ° C) лечение бактериофагом было прекращено, а назначен цефалоспорин третьего поколения. Через 48 ч после начала антибактериальной терапии температура тела нормализовалась (24 ч: 37,8 ° C; 48 ч: <37,5 ° C). В данном конкретном случае инфекция была вызвана P. aeruginosa , который, как известно, выделяет эндотоксины во время своего лизиса.

Вторичное бактериологическое исследование образцов мочи, взятых после обработки бактериофагом, продемонстрировало положительную тенденцию в терапии инфекции, в частности, снижение количества бактерий в диапазоне от 1 до 5 log (случаи № 1, 2, 5, 6).В одном случае (№6) вторичный бактериологический анализ после терапии бактериофагом показал, что моча стала ниже предела обнаружения среды Uriselect TM 4 (10 4 КОЕ / мл для уропатогенов). В двух случаях (№ 4, № 8) исходные инфекции, E. coli (титр 10 7 КОЕ / мл) и Enterococcus (титр 10 6 КОЕ / мл), соответственно, исчезли после бактериофага. терапия; однако наблюдалось присутствие непатогенной микрофлоры, которая не требовала дальнейшего лечения.Примечательно, что в этих двух случаях непатогенная флора появилась у пациентов в возрасте 69–80 лет, что может быть результатом затруднений мочеиспускания, сохраняющихся даже после операции. В одном случае (№ 3) титр E. coli не изменился после обработки бактериофагом. В случае (№7) начальная инфекция, вызванная Enterococcus (титр 10 6 КОЕ / мл) после терапии бактериофагом была заменена на E. coli (титр 10 7 КОЕ / мл), что может быть отнесено на счет к вторичной инфекции.

Хотя дизайн и количество случаев, а также разнообразие результатов, описанных в этой публикации, не позволяют сделать какие-либо статистически надежные выводы, тенденция, указанная в данных нашего исследования, не является самостоятельной и хорошо согласуется с исходом. из нескольких других недавно зарегистрированных случаев использования бактериофаговой терапии в западных странах (Abedon et al., 2017). Что касается безопасности, результаты нашего проспективного двухфазного исследования подтверждают ранее сделанные выводы о том, что терапия бактериофагами с использованием коктейлей бактериофагов широкого спектра действия, включая бактериофаг Pyo, безопасна (McCallin et al., 2013, 2018; Sarker et al., 2016). Однако для окончательного вывода об эффективности лечения бактериофагами срочно необходимы хорошо спланированные РКИ.

Из-за слишком широкого использования антибиотиков в современном обществе появление патогенов, резистентных к антибиотикам, стало серьезной проблемой с точки зрения роста заболеваемости и смертности, а также повышенных затрат на здравоохранение, что было доведено до сведения общественности несколькими национальными организациями. и международные агентства по охране здоровья (CDC, 2013; European Center for Disease et al., 2017; Leitner et al., 2017). Поскольку механизм устойчивости бактерий к бактериофагам отличается от механизма устойчивости к антибиотикам, а также поскольку бактериофаги являются самовоспроизводящимися и саморазвивающимися объектами, бактериофаговая терапия может использоваться в качестве альтернативного метода устранения устойчивых к антибиотикам бактерий. Одним из основных ограничений для принятия и повторного применения бактериофаговой терапии является отсутствие плацебо-контролируемых двойных слепых РКИ в соответствии с западными стандартами (Круглый стол экспертов по принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии, 2016).Мы ожидаем, что рандомизированное контролируемое исследование, которое мы предшествовали настоящему открытому исследованию, будет способствовать заключению об эффективности, стоимости и преимуществах бактериофагов в случае устойчивых к антибиотикам уропатогенных бактерий.

Наконец, мы хотели бы отметить, что до того, как бактериофаги смогут стать общепринятыми и широко применяться для лечения определенных бактериальных инфекций, как это уже практикуется в нескольких странах Восточной Европы, необходимо скорректировать законодательную базу в западном мире. Поскольку внутренняя сила бактериофагов связана с их потенциалом антагонистической эволюции с их бактериальными хозяевами, состав эффективных коктейлей бактериофагов не будет статическим, а будет адаптироваться и корректироваться с течением времени, что обеспечивает эффективность в отношении развития бактериальных инфекций в разные моменты времени в разных местах для разных группы пациентов.Однако такой динамичный подход несовместим с сегодняшними требованиями к производству и допуску химических препаратов. Хотя использование бактериофагов уже довольно старое, примечательно признать, что на самом деле более индивидуальная разработка и применение бактериофагов соответствуют растущим потребностям и возможностям, связанным с персонализированным питанием и персонализированной медициной. Недавний прорыв в этой дискуссии был отмечен в Бельгии, где национальные власти договорились о создании практической системы бактериофаговой терапии, которая касается магистральной подготовки (фармацевтическая аптека в Соединенных Штатах) индивидуальных бактериофаговых препаратов (Pirnay et al., 2018). Ожидается, что эта бельгийская система «магистральной медицины бактериофагов» будет достаточно гибкой для использования и дальнейшего изучения специфической природы бактериофагов как совместно развивающихся антибактериальных средств, отдавая приоритет безопасности пациентов.

Заключение

В нашем проспективном двухфазном исследовании, предшествовавшем плацебо-контролируемому двойному слепому РКИ, циклы адаптации повысили чувствительность in vitro 118 штаммов к коммерчески доступному бактериофагу Pyo с 41% до 75%.В экспериментальной серии in vivo можно было продемонстрировать многообещающий клинический и микробиологический эффект и отличную переносимость адаптированного лечения бактериофагом Pyo. Наши результаты показывают, что терапия бактериофагами может быть эффективной и безопасной для лечения ИМП. Таким образом, хорошо спланированные рандомизированные контролируемые исследования имеют большое значение для дальнейшего определения роли этого потенциально революционного варианта лечения.

Авторские взносы

Все авторы внесли свой вклад в разработку и организацию клинического исследования.AU проводила обработку бактериофагом. NC и MG провели все работы, связанные с бактериофагами. NC и WS составили рукопись. AU, MG, UM и AC критически рассмотрели рукопись. LL и TK сделали окончательное редактирование рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано Швейцарским фондом Continence (www.swisscontinencefoundation.ch), Швейцарским национальным научным фондом (www.snsf.ch) и Швейцарским агентством по развитию и сотрудничеству в рамках программы SCOPES (Scientific co- операция между Восточной Европой и Швейцарией, грант No.152304).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.01832/full#supplementary-material

Сноска

  1. http: // ctep.Cance.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm

Список литературы

Абрамс П., Кардозо Л., Фолл М., Гриффитс Д., Розье П., Ульмстен У. и др. (2002). Стандартизация терминологии функции нижних мочевыводящих путей: отчет подкомитета по стандартизации международного общества сдерживания. Neurourol. Уродын. 21, 167–178. DOI: 10.1002 / nau.10052

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аппельманс, Р.(1921). Le дозировка бактериофагов. C. R. Soc. Биол. 85, 1098–1099.

Google Scholar

Барри, М. Дж., Фаулер, Ф. Дж. Мл., О’лири, М. П., Брускевиц, Р. К., Хольтгрев, Х. Л., Мебуст, В. К. и др. (1992). Индекс симптомов доброкачественной гиперплазии предстательной железы, разработанный американской урологической ассоциацией. Измерительная комиссия американской урологической ассоциации. J. Urol. 148, 1549–1557; обсуждение 1564. doi: 10.1016 / S0022-5347 (17) 36966-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бонкат, Г., Пикард, Р., Бартолетти, Р., Кай, Т., Брюьер, Ф., Герлингс, С. Э. и др. (2018). Рекомендации Европейской ассоциации урологов (EAU) по урологическим инфекциям. Доступно по адресу: http://uroweb.org/guideline/urological-infections/ [по состоянию на 11 апреля 2018 г.].

Google Scholar

Чанишвили, Н. (2012). Обзор литературы о практическом применении исследования бактериофагов. Тбилиси: Институт бактериофага, микробиологии и вирусологии им. Георгия Элиава.

Google Scholar

Cornu, J. N., Ahyai, ​​S., Bachmann, A., De La Rosette, J., Gilling, P., Gratzke, C., et al. (2015). Систематический обзор и метаанализ функциональных исходов и осложнений после трансуретральных процедур по поводу симптомов нижних мочевыводящих путей, вызванных доброкачественной обструкцией предстательной железы: обновленная информация. Eur. Урол. 67, 1066–1096. DOI: 10.1016 / j.eururo.2014.06.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Европейский центр профилактики и контроля заболеваний, Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов и Европейское агентство по лекарственным средствам (2017).Второй совместный отчет ECDC / EFSA / EMA о комплексном анализе потребления противомикробных препаратов и возникновения устойчивости к противомикробным препаратам у бактерий, полученных от людей и сельскохозяйственных животных. EFSA J. 15: 4872.

Google Scholar

Круглый стол экспертов по принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии (2016). Шелковый путь к принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии. Biotechnol. J. 11, 595–600. DOI: 10.1002 / биот.201600023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грация, А. (1936). Численное соотношение между лизогенными бактериями и фаговыми частицами, которые они несут. Ann. Inst. Пастер 57, 652–676.

Google Scholar

Хутон, Т. М., Брэдли, С. Ф., Карденас, Д. Д., Колган, Р., Герлингс, С. Е., Райс, Дж. С. и др. (2010). Диагностика, профилактика и лечение катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей у взрослых: Международное руководство по клинической практике 2009 г. от общества инфекционистов Америки. Clin. Заразить. Дис. 50, 625–663. DOI: 10.1086 / 650482

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купелиан В., Вэй, Дж. Т., О’лири, М. П., Кусек, Дж. У., Литман, Х. Дж., Линк, К. Л. и др. (2006). Распространенность симптомов со стороны нижних мочевыводящих путей и их влияние на качество жизни в случайной выборке, различающейся по расовому и этническому признаку: обследование здоровья населения Бостонской области (BACH). Arch. Междунар. Med. 166, 2381–2387. DOI: 10.1001 / archinte.166.21.2381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куттер, Э., Де Вос, Д., Гвасалия, Г., Алавидзе, З., Гогохия, Л., Куль, С., и др. (2010). Фаговая терапия в клинической практике: лечение инфекций человека. Curr. Pharm. Biotechnol. 11, 69–86. DOI: 10.2174 / 138920110790725401

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лейтнер, Л., Сибесма, В., Чанишвили, Н., Годердзишвили, М., Чхотуа, А., Уджмаджуридзе, А. и др. (2017).Бактериофаги для лечения инфекций мочевыводящих путей у пациентов, перенесших трансуретральную резекцию простаты: рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое клиническое исследование. BMC Urol. 17:90. DOI: 10.1186 / s12894-017-0283-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин, С. А., Харен, М. Т., Маршал, В. Р., Ланге, К., Уиттерт, Г. А., и члены Исследования мужского старения Флори Аделаиды (2011). Распространенность и факторы, связанные с неосложненным хранением и опорожнением нижних мочевыводящих путей у мужчин из Австралии. Мир J. Urol. 29, 179–184. DOI: 10.1007 / s00345-010-0605-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакКаллин, С., Алам Саркер, С., Барретто, К., Султана, С., Бергер, Б., Хук, С. и др. (2013). Анализ безопасности коктейля российских фагов: от метагеномного анализа до перорального применения у здоровых людей. Вирусология 443, 187–196. DOI: 10.1016 / j.virol.2013.05.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакКаллин, С., Саркер, С.А., Султана, С., Охслин, Ф., и Брюссоу, Х. (2018). Метагеномный анализ российских и грузинских коктейлей пиофагов и плацебо-контролируемое испытание безопасности одного фага по сравнению с коктейлем фага у здоровых носителей Staphylococcus aureus . Environ. Microbiol. DOI: 10.1111 / 1462-2920.14310 [Epub перед печатью].

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мерабишвили, М., Пирнай, Ж.-П., и Де Вос, Д. (2018). «Рекомендации по составлению идеального коктейля бактериофагов», в «Терапия бактериофагами: от лаборатории к клинической практике» , ред.Азередо и С. Силланкорва (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer), 99–110.

Google Scholar

Николь, Л. Е., Брэдли, С., Колган, Р., Райс, Дж. К., Шеффер, А., и Хутон, Т. М. (2005). Руководство Американского общества инфекционистов по диагностике и лечению бессимптомной бактериурии у взрослых. Clin. Заразить. Дис. 40, 643–654. DOI: 10.1086 / 427507

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pirnay, J.-P., Verbeken, G., Ceyssens, P.-J., Huys, I., De Vos, D., Ameloot, C., et al. (2018). Магистральный фаг. Вирусы 10: E64. DOI: 10.3390 / v10020064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саркер, С. А., Султана, С., Ройтелер, Г., Мойн, Д., Декомб, П., Чартон, Ф. и др. (2016). Пероральная фаговая терапия острой бактериальной диареи двумя препаратами колифага: рандомизированное исследование на детях из Бангладеш. EBioMedicine 4, 124–137. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2015.12.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schneidewind, L., Kranz, J., Schlager, D., Barski, D., Muhlsteadt, S., Grabbert, M., et al. (2017). Многоцентровое исследование по антибиотикопрофилактике, инфекционным осложнениям и оценке риска при ТУР-П. Cent. Европейский J. Urol. 70, 112–117. DOI: 10.5173 / ceju.2017.941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sybesma, W., Zbinden, R., Chanishvili, N., Kutateladze, M., Чхотуа А., Уджмаджуридзе А. и др. (2016). Бактериофаги как потенциальное средство лечения инфекций мочевыводящих путей. Фронт. Microbiol. 7: 465. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00465

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Труцци, Дж. К., Алмейда, Ф. М., Нуньес, Э. К., и Сади, М. В. (2008). Остаточный объем мочи и инфекция мочевыводящих путей - когда они связаны? J. Urol. 180, 182–185. DOI: 10.1016 / j.juro.2008.03.044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вильярроэль, Дж., Ларсен, М.В., Килструп, М., и Нильсен, М. (2017). Метагеномный анализ терапевтических коктейлей фагов PYO с 1997 по 2014 гг. Вирусы 9: E328. DOI: 10.3390 / v9110328

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

.

Бактериофаг - статья в энциклопедии - Citizendium

Бактериофаг («пожиратель бактерий», от «бактерии» и греч. Φαγειν, «есть») представляет собой вирус, поражающий бактерии. Этот термин чаще всего используется в сокращенной форме: фаг. Бактериофаг впервые оказался частью биологического мира в наше время, менее ста лет назад. Сама по себе микробная теория болезней возникла только в 19 веке и принесла такое новое понимание того, как распространяются инфекционные заболевания, что медицина пережила революционный прорыв с ее принятием.Удивительный вывод о том, что сами микробы могут иметь и микробов, был сделан только после того, как методы, использованные при открытии вирусов в начале 20 века, были использованы для изучения некоторых загадочных наблюдений, касающихся болезней саранчи, культуры бактерий и священных вод река Ганга.

Оказывается, бактерии часто заражаются вирусами, называемыми бактериофагами, и являются для них «хозяевами», так же как тела людей, растений и других животных являются переносчиками как бактерий, так и вирусов.Фаги распространены повсеместно и могут быть обнаружены во всех средах обитания, населенных бактериальными клетками, в которые эти вирусы должны проникать, чтобы иметь возможность воспроизводиться. Эти среды обитания невероятно разнообразны и включают почву, кишечник животных и море. Ученые ищут в этих местах обитания фаги для изучения.

Например, одним из самых богатых природных источников является морская вода, где планктон и бактерии являются хозяевами для фагов. Поскольку плотность хозяев в морской воде настолько велика, можно найти до 10 7 фагов (или, по крайней мере, вирусоподобных частиц) на 1 мл морской воды [1] .В глобальном масштабе Whitman et al. утверждают, что на нашей планете насчитывается от 10 30 до 10 31 прокариотических клеток. [2] Если предположить, что на каждую прокариотную клетку приходится один вирус (и иметь в виду, что большинство протестированных бактериальных клеток содержат латентный фаг (профаг)), то мы консервативно достигнем общей численности населения 10 30 до 10 31 этих вирусоподобных частиц в мире. [3] Изображение Synechococcus Phage S-PM2, полученное с помощью просвечивающего электронного микроскопа, Ханс-Вольфганг Акерманн.

История

В 1896 году М. Э. Ханкин сообщил, что или в водах рек Ганг и Джумна в Индии оказали заметное антибактериальное действие против бактерий, вызывающих болезнь, холеру. Тестирование этих вод показало, что это подавление роста бактерий сохранялось даже при пропускании воды через очень тонкий фарфоровый фильтр. [4] Это означало, что то, что было ответственно за уничтожение культур Vibrio cholera , было меньше любой известной бактерии, ни одна из которых не могла пройти через крошечные поры, присутствующие в этом плотном керамическом фильтре.К сожалению, это наблюдение не было продолжено.

В 1915 году Фредерик Творт, британский врач и бактериолог, описал бактериофаги (не называя их так), обнаруженные при необычной «стекловидной трансформации» определенных бактериальных колоний, выращенных им в своей лаборатории. Эта лаборатория и его способность проводить в ней независимые исследования были привилегией на его посту суперинтенданта Института Брауна Лондонского университета (ветеринарная больница). Какой-то материал, произведенный этими бактериальными колониями, убил их, и именно Творт показал, что эти агенты были настолько маленькими частицами, что могли проходить через фарфоровый фильтр.Кроме того, они размножались, вызывая гибель бактериальных культур. Понимая, что этот агент должен быть меньше любой известной бактерии, он подозревал, что это может быть либо 1) стадия жизненного цикла некоторых бактерий, 2) химический фермент, производимый бактериями, либо 3) вирус, который растет и уничтожает бактерии. [5] Работа Творта была прервана началом Первой мировой войны, но когда он вернулся в Институт Брауна, он провел остаток своей карьеры, пытаясь вырастить этот агент на искусственных средах, поддерживающих рост бактерий.Конечно, бактериофаги - это вирусы, и, как и все вирусы, без его ведома, они могут «жить» только в клетках, а не на искусственных питательных средах, поэтому его исследования никогда не увенчались успехом. Тем не менее, он пришел к выводу, что фильтруемые частицы убивают бактерии - и увеличивают их собственное количество в процессе этого: основные действия бактериофага.

Независимо, франко-канадский микробиолог Феликс д'Эрелль, работающий в Институте Пастера в Париже, объявил 3 сентября 1917 года, что он обнаружил «невидимый, антагонистический микроб дизентерийной палочки». [6] For d 'Herelle, не было никаких сомнений относительно природы его открытия: «В мгновение ока я понял: причиной моих светлых пятен на самом деле был невидимый микроб.... вирус, паразитирующий на бактериях. "Д'Эрелль назвал вирус бактериофагом. Его открытие произошло в результате культивирования дизентерийной палочки у пациента в больнице, чей конкретный штамм патогенных бактерий был инфицирован фагом. Д'Эрелль отметил, что фильтрация культур бактерий, которые показали очищение, и добавление этого фильтрата к активно растущим культурам бактерий того же вида, полностью уничтожили популяцию бактерий. Он коррелировал этот результат с собственным выздоровлением пациента, которое он приписал антибактериальным препаратам. действия фага и его прошлой работе с саранчой.Эта работа впервые продемонстрировала ему феномен переносимого агента, способного удалять участки роста в бактериальных культурах. Несколькими годами ранее он изучал бактериальную диарею саранчи, которая была настолько серьезной, что распространение этой болезни было полезным для борьбы с насекомыми в сельском хозяйстве. В то время, когда он культивировал бактерии из аномальных продуктов жизнедеятельности насекомых, он обнаружил, что на некоторых культурах были странные прозрачные пятна. Хотя в то время он также обнаружил, что агент, ответственный за очистку от бактерий, может быть перенесен из одной культуры в другую, он не был уверен в значении этих открытий.Возможно, именно этот агент сам был ответственен за болезнь саранчи, и бактерии из их кишечника могли быть лишь случайным изолятом. Позже, изучая бактерии, вызывающие дизентерию человека, как только что было отмечено, он понял, что вместо этого агенты, отвечающие за очищение, на самом деле антагонистичны причине диареи, причем как в случае людей, так и в случае насекомых причиной является дизентерийная палочка. [7] Дакворт (1976) представляет подробный исторический отчет об открытии бактериофагов. [8]

Основные открытия с фагами

Ранняя история бактериофагов позволяет предположить, что их исследование будет немедленно применено для лечения заболеваний, вызываемых бактериями. Это был не тот случай; вместо этого антибиотикотерапия стала основой лечения бактериальных заболеваний. Однако важность бактериофага для развития биологической науки невозможно переоценить. Бактериофаги интенсивно изучались в течение десятилетий после их открытия, и они стали играть ведущую роль в развитии фундаментальной науки микробиологии и новой биологии молекулярной генетики.В 1940-х годах и позже именно лабораторные исследования биологии фагов напрямую помогли проникнуть в суть бактериальной генетики, молекулярной биологии и точного способа размножения и распространения вирусов. Эти открытия включают:

Электронная микрофотография отрицательно окрашенных Prochlorococcus Myoviruses P-SSM2 и P-SSM4. Шкала показывает 100 нм. Нажмите на изображение для получения дополнительной информации.

Конструкция

Большинство фагов имеют длину 24–200 нм по сравнению с типичной бактериальной клеткой, которая может иметь длину около 1000 нм, что, в свою очередь, составляет 1/1000 миллиметра = 1 микрон в длину.

Каждый фаг имеет структуру головы, которая может различаться по размеру и форме. Одни икосаэдрические (20 сторон), другие нитевидные. Голова (или капсид ) состоит из множества копий одного или нескольких типов белка и содержит генетический материал фага (то есть нуклеиновую кислоту). Генетический материал может быть оцРНК, дцРНК, оцДНК или дцДНК длиной от 5 до 500 килопар оснований (т.п.н.) в круговой или линейной структуре.

Многие, но не все фаги имеют хвосты, прикрепленные к фаговой головке.Хвост представляет собой полую трубку, через которую проходит нуклеиновая кислота во время инфекции, и его размер может значительно варьироваться. У более сложных фагов, таких как Т4, хвост окружен сократительной оболочкой, которая сокращается во время инфицирования бактерии. На конце хвоста у некоторых фагов есть базовая пластинка и прикрепленные к ней одно или несколько хвостовых волокон; эти структуры участвуют в прикреплении фага к бактериальной клетке.

Классификация

Алфавитный список семейств бактериофагов:

Corticoviridae икосаэдрический капсид с липидным слоем, круговая суперскрученная дцДНК

Cystoviridae оболочка, икосаэдрический капсид, липиды, три молекулы линейной дцРНК

Fuselloviridae плеоморфный, конверт, липиды, без капсида, круговая суперскрученная дцДНК

Inoviridae, род Inovirus длинные волокна со спиральной симметрией, круговая оцДНК

Inoviridae, род Plectrovirus короткие стержни со спиральной симметрией, круговая оцДНК

Leviviridae квазиикосаэдрический капсид, одна молекула линейной оцРНК

Lipothrixviridae обволакивающие филаменты, липиды, линейная дцДНК

Микровирусы икосаэдрический капсид, круговая оцДНК

Myoviridae, A1 хвост сократительный, голова изометрическая

Myoviridae, A2 хвост сократительный, голова удлиненная (отношение длины к ширине = 1.3-1,8)

Myoviridae, A3 хвост сократительный, голова удлиненная (отношение длины к ширине = 2 и более)

Plasmaviridae плеоморфный, конверт, липиды, без капсида, круговая суперскрученная дцДНК

Podoviridae, C1 хвост короткий и несокращающийся, голова изометрическая

Podoviridae, C2 хвост короткий и несокращающийся, голова удлиненная (соотношение длина / ширина = 1,4)

Podoviridae, C3 хвост короткий и несокращающийся, голова удлиненная (отношение длины к ширине = 2,5 и более)

Рудивириды спиральные стержни, линейная дцДНК

Siphoviridae, B1 хвост длинный и несокращающийся, голова изометрическая

Siphoviridae, B2 хвост длинный и несокращающийся, голова удлиненная (отношение длины к ширине = 1.2-2)

Siphoviridae, B3 хвост длинный и несокращающийся, голова удлиненная (отношение длины к ширине = 2,5 или более)

Tectiviridae

Реплика

Бактериофаги - облигатные паразиты: для размножения они должны проникать в бактериальные клетки-хозяева. Оказавшись внутри клетки-хозяина, фаги захватывают механизм репликации ДНК клетки-хозяина и побуждают хозяина производить больше фагов. Большинство бактериофагов проходят литический жизненный цикл: когда образуется достаточное количество потомков фага (обычно ~ 100), клетки-хозяева будут вскрыты (лизированы) и погибнут.После лизиса потомство фага выходит из клетки и диффундирует к новым хозяевам.

Приложение

Чтобы проникнуть в клетку-хозяина, бактериофаги прикрепляются к специфическим рецепторам на поверхности бактерий, включая липополисахариды, тейхоевые кислоты, белки или даже жгутики. Другими словами, фаг может проникнуть в клетку только через определенную особенность, которую он «распознает», и не способен заразить бактерию, у которой отсутствует привлекательная особенность. У каждого типа фага есть только определенный набор функций, которые он распознает.Это означает, что бактериофаг может проникать только в бактерии, несущие определенные типы рецепторов, с которыми они могут связываться, и именно эти входные порты определяют «диапазон хозяев» фага. Считается, что фаги обладают «специфичностью» по отношению к бактериям, которые они действительно заражают. Поскольку вирионы фагов не перемещаются, они полагаются на случайные встречи с нужными рецепторами, когда они находятся в растворе (например, в воде, крови или лимфатической циркуляции). Считается, что сложные бактериофаги, такие как Т-четные фаги, используют движение, похожее на шприц, для введения своего генетического материала в клетку.После контакта с соответствующим рецептором хвостовые волокна приближают пластинку основания к поверхности клетки. После того, как он полностью прикреплен, конформационные изменения в белках заставляют хвост сокращаться, возможно, с помощью АТФ, присутствующего в хвосте. [22] Другие бактериофаги могут использовать другие методы для вставки своего генетического материала. Хотя генетический материал может проходить через мембрану, он также может откладываться на поверхности клетки.

Синтез белков и нуклеиновых кислот

В течение короткого времени, иногда всего за несколько минут, бактериальные рибосомы начинают транслировать вирусную мРНК в белок.Для фагов на основе РНК на ранних этапах процесса синтезируется РНК-репликаза, ферментный катализатор, участвующий в генетической репликации. Ранние белки и некоторые белки, которые присутствовали в вирионе, могут модифицировать бактериальную РНК-полимеразу, так что она предпочтительно транскрибирует вирусную мРНК. Нормальный синтез белков и нуклеиновых кислот в организме хозяина нарушается, и он вынужден производить вирусные продукты. Эти продукты становятся частью новых вирионов внутри клетки, вспомогательных белков, которые помогают собирать новые вирионы, или белков, участвующих в лизисе клетки.

Вирион в сборе

В случае фага T4 создание новых вирусных частиц - сложный процесс, требующий помощи специальных «вспомогательных» молекул. Сначала собирается опорная плита, а затем на нее надстраивается хвост. Головной капсид, построенный отдельно, самопроизвольно соединяется с хвостом. ДНК эффективно упакована внутри головы неизвестным пока образом. Весь процесс занимает около 15 минут. Просвечивающая электронная микрофотография тонкого среза Escherichia coli K-12, инфицированного бактериофагом Т4.Увеличение 25,000X. © Авторское право принадлежит Джону Верцу. Используется с разрешения.

Выпуск вирионов

Фаги могут высвобождаться посредством лизиса клеток или секреции клеток-хозяев. В фаге Т4 более трехсот фагов высвобождаются посредством лизиса примерно через двадцать минут после инъекции. Лизис хозяина обычно достигается с помощью фермента, называемого эндолизином, который атакует и разрушает структуру клеточной стенки, окружающую бактериальную клетку, которая состоит из сополимера сахара и аминокислоты, называемого пептидогликаном.Некоторые фаги, такие как фаг лямбда Escherichia coli , также используют дополнительный белок, называемый холином, для образования повреждений в цитоплазматической мембране хозяина.

Лизогенный жизненный цикл

Некоторые фаги, такие как фаг Лямбда , помимо литического цикла проходят второй тип жизненного цикла, называемый лизогенным циклом. В отличие от литического цикла лизогенный цикл не приводит к лизису клетки-хозяина. Фаги, способные подвергаться лизогению, известны как фаги умеренного климата.Их вирусный геном будет интегрироваться с ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ним довольно безвредно или даже может стать плазмидой. Таким образом, клетка-хозяин продолжает выживать и воспроизводиться, а фаг автостопщика воспроизводится во всем потомстве клетки. Иногда профаги могут принести пользу бактериям-хозяевам, пока они находятся в спящем состоянии, добавляя новые функции к бактериальному геному в результате явления, называемого лизогенным преобразованием. Известным примером является превращение фагом безвредного штамма Vibrio cholerae в высоковирулентный, вызывающий холеру.Жизненный цикл лямбда и генная организация. См. Примечания к изображению для получения дополнительной информации.

В целом, когда клетки-хозяева активно растут и условия окружающей среды благоприятны, фаги умеренного климата будут использовать литический путь. Когда условия окружающей среды ухудшаются, фаги умеренного климата имеют тенденцию вступать в лизогенный путь (Пташне, 2004). Это правдоподобно, потому что голодные клетки-хозяева могут не иметь компонентов, необходимых для размножения фага; более того, условия окружающей среды могут не благоприятствовать выживанию фагов вне клетки.Может быть, выгоднее оставаться в хозяине, чем вступать во враждебную среду.

Экология фагов

Экология фагов - это изучение взаимодействия бактериофагов с окружающей их средой. Традиционная биология фагов сосредоточена в основном на характеристике биохимии и молекулярной биологии бактериофагов (см. Stent 1963). Недавняя работа была больше сосредоточена на роли бактериофага в окружающей среде, особенно в отношении фаговой органической, популяционной, общинной и экосистемной экологии. [23] Активный информационный центр по экологии фагов доступен на сайте www.phage.org.

Фаготерапия

Фредерик Творт продвигал использование фагов в качестве антибактериальных агентов вскоре после их открытия, но после их открытия антибиотики оказались более практичными. На Западе исследования фаговой терапии в основном прекратились, но фаговая терапия использовалась с 1940-х годов в бывшем Советском Союзе в качестве альтернативы антибиотикам для лечения бактериальных инфекций.

Поскольку большинство штаммов фагов могут инфицировать ограниченный круг бактериальных хозяев (от нескольких видов до только определенных подтипов внутри вида), фаговая терапия должна быть тщательно адаптирована к присутствию хозяина.Это может быть преимуществом, потому что никакие другие бактерии не подвергаются атаке, что делает терапию аналогичной антибиотику узкого спектра действия. Это также может быть недостатком при инфекциях, вызванных несколькими различными типами бактерий, что часто бывает. Иногда смеси нескольких штаммов фага используются для создания лекарства более широкого спектра действия. Еще одна проблема с бактериофагами заключается в том, что они атакуются иммунной системой организма.

Фаги работают лучше всего при прямом контакте с инфекцией, поэтому их часто наносят непосредственно на открытую рану.Это редко применимо в текущих клинических условиях, когда инфекции возникают системно. Несмотря на индивидуальный успех в бывшем Советском Союзе, многие исследователи, изучающие инфекционные заболевания, задаются вопросом, сможет ли фаговая терапия иметь какое-либо медицинское значение. Пока не проводилось крупных клинических испытаний для проверки эффективности фаговой терапии, но исследования продолжаются из-за роста множественной устойчивости к антибиотикам.

Институт бактериофагов, микробиологии и вирусологии имени Джорджа Элиава в Тбилиси, штат Джорджия (страна), является ведущей лабораторией, проводящей исследования фаговой терапии.

Другие применения бактериофагов

Безопасность пищевых продуктов

В августе 2006 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило использование бактериофагов на некоторых готовых к употреблению мясных продуктах для уничтожения потенциально смертельных бактерий Listeria monocytogenes . Добавка, известная как LMP-102 ™, представляет собой запатентованный коктейль из шести бактериофагов, специфичных для Listeria , от Intralytix, Inc. Intralytix также ищет одобрения FDA для лечения Escherichia coli O157: H7 и Salmonella .

Нанотехнологии

Еще одно крупное использование бактериофагов принадлежит компании Cambrios Technologies. Его основательница, доктор Анджела Белчер, впервые использовала бактериофаг M13 для создания нанопроволок и электродов. Она начала свое исследование с изучения того, как морские улитки создают свои раковины из вещей, которые естественным образом встречаются в их среде. В частности, она обнаружила, что улитки превращают морское ушко в две отдельные кристаллические структуры. Одна из структур была жесткой, другая - быстрорастущей.Она взяла эту концепцию и применила ее к бактериофагам. Одно из ее начинаний заключалось в имплантации золота и оксида кобальта в бактериофаг, чтобы создать электрод толщиной с бумагу: золото предназначалось для проводимости, а оксид кобальта - для фактического использования батареи.

Электронная микрофотография с отрицательным окрашиванием гамма-фага, из которого был клонирован литический фермент PlyG, для использования в контроле Bacillus anthracis . (Фотография любезно предоставлена ​​Винсентом Фишетти и Раймондом Шухом, Университет Рокфеллера.)

Экспериментальная эволюция бактериофага

Экспериментальная эволюция - это использование модельных организмов (например, Escherichia coli , дрожжи, лямбда-фаг) для изучения процесса эволюции в контролируемых экспериментах. Бактериофаги являются идеальными организмами для экспериментальных исследований эволюции из-за быстрого времени их генерации, малых размеров, простоты манипуляций, малых геномов и доступности молекулярно-генетических и биохимических деталей. Экспериментальная эволюция фагов является частью более широкого поля эволюции вирусов.

См. Здесь аннотированную библиографию современных экспериментальных исследований эволюции фагов.

Как мы уже видели, изучение бактериофагов - это процветающая наука, которая внесла свой вклад в некоторые фундаментальные открытия биологии. Помимо вклада в чистую науку, на горизонте, если не уже, есть многообещающие применения в области безопасности пищевых продуктов, медицины и нанотехнологий. Кто бы мог подумать, что такая маленькая частица окажется такой важной?

Список литературы

  1. ↑ Wommack KE, Colwell RR (2000).Вириопланктон: вирусы в водных экосистемах. Microbiol Mol Biol Rev 64: 69-114.
  2. ↑ Whitman WB et al. (1998) Прокариоты: невидимое большинство. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6578-83
  3. ↑ например Bergh O et al. (1989) Большое количество вирусов, обнаруженных в водной среде. Природа 340: 467-8
  4. ↑ Adhya S, Merril C (2006) Путь к фаговой терапии. Природа 443: 754-755 DOI: 10.1038 / 443754a
  5. ↑ Twort F.W (1915) Исследование природы ультрамикроскопических вирусов.Ланцет 2: 1241-3
  6. ↑ d'Herelle F (1917) Невидимый микроб-антагонист дизентерийной палочки. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L’academie des Sciences 165: 373-5
  7. ↑ Stent GS (1963) Молекулярная биология бактериальных вирусов . WH Freeman & Co.
  8. ↑ Дакворт Д.Х. (1976) Кто открыл бактериофаг? Bacteriol Rev 40: 793-802
  9. ↑ Luria SE, Delbruck M (1943) Мутации бактерий от чувствительности к вирусу до устойчивости к вирусу Генетика 28: 491-511
  10. ↑ Zinder ND, Lederberg J (1952) Генетический обмен в сальмонеллах .J Bacteriol 64: 679-99
  11. ↑ Hershey AD, Chase M (1952) Независимые функции вирусного белка и нуклеиновой кислоты в росте бактериофага. J Gen Physiol 36: 39-56
  12. ↑ Benzer S (1955) Тонкая структура генетической области бактериофага. Proc Natl Acad Sci USA 41: 344–54
  13. ↑ Волкин E, Astrachan L (1956) Внутриклеточное распределение меченой рибонуклеиновой кислоты после фаговой инфекции Escherichia coli . Вирусология 2: 433-7
  14. ↑ Campbell A (1962) Episomes.Успехи в генетике 11: 101-145
  15. ↑ Meselson M, Weigle JJ (1961) Разрыв хромосомы, сопровождающий генетическую рекомбинацию в бактериофаге. Proc Natl Acad Sci USA 47: 857-68.
  16. ↑ Jacob F, Monod J (1961) Генетические регуляторные механизмы в синтезе белков. J Mol Biol 3: 318-356.
  17. ↑ Crick FH et al. (1961) Общая природа генетического кода белков. Природа 192: 1227-32
  18. ↑ Sarabhai AS et al. (1964) Коллинеарность гена с полипептидной цепью.Природа 201: 13-
  19. ↑ Gellert M (1967) Формирование ковалентных кругов лямбда-ДНК экстрактами Escherichia coli . Proc Natl Acad Sci USA 57: 148-55.
  20. ↑ Пташне М. (1967) Выделение репрессора фага лямбда. Proc Natl Acad Sci USA 57: 306–13
  21. ↑ Пташне М (2004) A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited . 3-е изд. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор. ISBN: 0879697172
  22. ↑ Прескотт Л. (1993) Микробиология . WC Brown Publishers, ISBN 0-697-01372-3
  23. ↑ Goyal SM et al. (1987) Экология фагов . Джон Уайли и сыновья, Нью-Йорк. ISBN 0471824194
    • Abedon ST (2006) Экология фагов. Стр. 37-46 в R. Calendar и S.T. Абедон, ред. Бактериофаги , 2-е изд., Oxford University Press. ISBN 0195148509
    • Brussow H, Kutter E (2005) Экология фагов. Стр. 129–163 у Э. Куттера и А. Сулаквелидзе, ред. Бактериофаги: биология и применение . CRC Press. ISBN: 0849313368
.

границ | Новые методы исследования бактериофаговой инфекции на одноклеточном уровне

Результаты заражения фагом остаются в значительной степени неизвестными для некультурных хозяев

Фаги и их бактериальные хозяева широко распространены в различных экосистемах, где бы они ни проводились исследования, включая пресную воду (Hennes and Simon, 1995), морскую воду (Bergh, 1989; Fuhrman, 1999; Wommack and Colwell, 2000), отложения (Danovaro et al., 2002), почва (Ashelford et al., 2003; Salifu et al., 2013) и человеческий рот, кишечник и дыхательные пути (Hitch et al., 2004; Летаров, Куликов, 2009; Willner et al., 2009; Stern et al., 2012; Reyes et al., 2013). Фаги влияют на глобальный биогеохимический цикл, манипулируя популяциями хозяев посредством смертности, горизонтального переноса генов и вирусного метаболического перепрограммирования. Во-первых, лизис микробных клеток, вызванный фагом, высвобождает органическое вещество и способствует круговороту углерода, азота и фосфора (Shelford et al., 2012; Jover et al., 2014). Во-вторых, опосредованный вирусами горизонтальный перенос генов может иметь серьезные последствия для эволюционных траекторий хозяина.В океанах цианобактериальные вирусы (цианофаги) захватили основные гены фотосистем, которые изменяют эволюционную траекторию этих глобально распределенных фотосистем (Lindell et al., 2004; Sullivan et al., 2006). В медицине факторы вирулентности, кодируемые профагами, обычно превращают хозяев в патогены (например, Clostridium botulinum , Corynebacterium diphtheria , Streptococcus pyogenes и Vibrio cholera ), которые вызывают заболевания у людей (Davis et al., 1999; Вагнер и Уолдор, 2002; Броуди и Фишетти, 2003; Брюссов и др., 2004; Мокроусов, 2009). Наконец, кодируемые вирусом «вспомогательные метаболические гены» (AMGs, sensu ; Breitbart et al., 2007) могут напрямую изменять метаболическую обработку инфицированных клеток в сторону от их неинфицированного состояния с известными последствиями для фотосинтеза (Mann et al., 2003 ; Dammeyer et al., 2008; Sharon et al., 2009; Thompson et al., 2011, и как указано выше), почти весь центральный углеродный метаболизм (Hurwitz et al., 2013b) и связанный цикл углерода и серы (Anantharaman и другие., 2014; Roux et al., 2014).

Несмотря на очевидную важность результатов взаимодействия вируса с хозяином для функционирования экосистемы, наши знания в значительной степени сдерживаются из-за выращивания и технических ограничений. Лишь небольшая часть (<1%) микробов в природе растет в типичных лабораторных условиях (Rappe and Giovannoni, 2003), и лишь немногие из 50 известных бактериальных типов имеют культивируемые фаги, в которых преобладают три типа, включая Cyanobacteria (например, Suttle и Чан, 1993; Лу и др., 2001; Sullivan et al., 2003), Proteobacteria (например, Ceyssens et al., 2010; Fogg et al., 2011; Wittmann et al., 2014) и Bacteroidetes (например, Holmfeldt et al., 2013, 2014). Такие модельные системы чрезвычайно ценны для проверки экспериментальных гипотез и представляют собой золотой стандарт для развития механистического понимания динамики и исходов конкретной инфекции фага-хозяина. Однако даже в то время, когда в культуру входят новые и экологически многочисленные системы фаг-хозяин (например,g., фаги SAR11 и SAR116; Канг и др., 2013; Zhao et al., 2013), маловероятно, что подходы, основанные на культивировании, смогут отобразить огромную сеть взаимодействий фаг-хозяин в природных экосистемах.

В дополнение к установлению справочных данных, представляющих некоторую часть виросферы, существует потребность в более точной количественной оценке относительной важности исходов взаимодействия фаг-хозяин в природе. Наиболее часто описываемые жизненные циклы фагов являются литическими и лизогенными. Литические фаги инфицируют клетки и используют аппарат хозяина для репликации своих нуклеиновых кислот (Young, 1992; Catalão et al., 2013). После самосборки капсидных белков с их геномами ДНК / РНК, клетки-хозяева лизируются, высвобождая 10–100 потомков во внеклеточную среду, которые затем стремятся инфицировать другие клетки. Напротив, фаги умеренного климата инфицируют клетку, а затем либо продолжают литическую инфекцию, либо входят в лизогению, в результате чего хромосома фага поддерживается либо интегрированной в хромосому хозяина, либо внехромосомно (Jiang and Paul, 1998; Little, 2005). При определенных условиях (например, УФ-излучение, химические вещества, питательные вещества) умеренные фаги индуцируются в литическом цикле для производства фагов-потомков и лизирования клеток.Литические фаги воздействуют на экосистему, уменьшая численность восприимчивых хозяев и высвобождая органическое вещество из лизированных клеток. Лизогения может улучшить приспособленность хозяина (Anderson et al., 2011a), включая увеличение скорости роста (Edlin et al., 1975), устойчивость к суперинфекции другими фагами (Bossi et al., 2003), устойчивость к стрессорам (Wang et al. , 2010), и вирулентность микроба-хозяина по отношению к его эукариотическому хозяину (Fortier and Sekulovic, 2013).

Известно, что помимо литического и лизогенного циклов фаги хронически заражают своих хозяев или вступают в псевдолизогению.Хронически инфицирующие фаги продуцируют потомство, которое медленно отходит от клетки или передается дочерним клеткам без лизиса клеток в любое время (Weinbauer, 2004; Díaz-Muñoz and Koskella, 2014). Точно так же псевдолизогенное состояние (иногда известное как «состояние носителя»), которое плохо изучено, не подразумевает ни интеграции генома фага в геном хозяина, ни лизиса клетки-хозяина (Weinbauer, 2004; Lood and Collin, 2011; Díaz-Muñoz and Koskella, 2014), а также может рассматриваться как хроническая инфекция.Считается, что эта стратегия заражения помогает фагам сохраняться в организме хозяина при недостатке питательных веществ для поддержания нормального роста микробов. Однако оба явления недостаточно описаны в естественных сообществах, и их экологические последствия остаются количественно неизвестными, по крайней мере частично, из-за отсутствия подходящих методов.

Это оставляет без ответа три фундаментальных вопроса: (1) , кто кого заражает , (2) , сколько процентов микробных клеток инфицировано в конкретный момент времени , и (3) , как инфекция прогрессирует с течением времени или при разных условиях. Условия выращивания .К счастью, некоторые из этих столь необходимых методов начинают появляться. К ним относятся вирусная маркировка (Deng et al., 2012) и вирусная маркированная метагеномика (Deng et al., 2014), скрининг фосмидных библиотек с большими вставками (Mizuno et al., 2013) и in silico связей, полученных из последовательности последовательностей. (Canchaya et al., 2003; Paul, 2008; Akhter et al., 2012) или идентификация CRISPR (Andersson, Banfield, 2008; Anderson et al., 2011b; Weinberger et al., 2012). Кроме того, независимый от состава последовательности подход метагеномного анализа (Albertsen et al., 2013) способствует восстановлению более полных геномов бактерий, в том числе редких по численности, что позволяет анализировать вирусные сигналы на уровне популяции. Хотя все эти методы невероятно эффективны для изучения геномных сигналов популяции в наборах данных, им не хватает возможности разработать единичную перспективу взаимодействия вируса с хозяином.

Здесь мы рассматриваем новые одноклеточные методы для изучения разнообразия фагов и исходов инфекции, уделяя особое внимание тем, которые также обеспечивают доступ к некультивируемым хозяевам.Эти методы используют информацию о последовательностях, которая становится все более доступной для поиска вирусных сигналов из наборов одноклеточных геномных данных и / или для разработки зондов и праймеров, нацеленных на определенные группы фаг-хозяин во времени и пространстве в сложных сообществах.

Извлечение «вируса» из некультивируемых одноклеточных амплифицированных геномов (SAG)

Экологи-микробиологи встают перед проблемой понимания «невидимого большинства» (Whitman et al., 1998) или «микробной темной материи» (Rinke et al., 2013) путем секвенирования одноклеточных амплифицированных геномов (SAG). Этот процесс работает путем выделения отдельных клеток из образца окружающей среды (например, микропипетирование, сортировка клеток с активацией флуоресценции, разделение микрофлюидных клеток), скрининга этих клеток с использованием секвенирования маркерных генов, а затем амплификации и секвенирования ДНК из интересующих клеток (Lasken , 2012; Macaulay, Voet, 2014). Исследователей обычно интересует, какой метаболизм связан с этими данными последовательности, чтобы связать известные метаболические процессы с их организменными «хозяевами».Однако такие данные также представляют собой сокровищницу для открытия новых вирусов. Например, анализ SAG выявил полный геном вируса с одноцепочечной ДНК, связанный с клеткой одной клады, но не с двумя другими морскими пикобилифитами (Yoon et al., 2011).

Помимо общих обследований, SAG предлагают возможность целенаправленного экологического и эволюционного изучения конкретных пар фаг-хозяин в природе, что представляет собой серьезную проблему в этой области и достижимо только с использованием культур.Например, недавнее исследование (Roux et al., 2014) в модельной зоне минимума кислорода в морской среде нацелено на фаги бактерий SUP05, некультивируемой группы, критически важной в этой среде для химиоавтотрофии, обусловленной циклическим круговоротом углеродных и серных питательных веществ (Wright et al. , 2012). Всего 127 SUP05 SAG секвенировали и анализировали на предмет вирусного сигнала, что привело к геномным эталонным последовательностям для 69 новых фагов (Roux et al., 2014). Распределение обнаруженных фагов по SAG предполагало, что около одной трети клеток SUP05 были инфицированы, с более высокой частотой инфицирования, когда клетки более активны.Сравнение этих новых эталонных геномов фагов с 189 наборами вирусных или микробных метагеномных данных показало, что фаги SUP05 сохраняли устойчивость в течение 3 лет в зоне минимального кислородного минимума, но были эндемичными с небольшими указаниями на вирусы, встречающиеся в каких-либо других наборах данных, доступных для популяционного уровня. анализ. Несомненно, по мере того, как становится доступным больше данных о микробных последовательностях, SAG будут предоставлять неоценимый ресурс для дальнейшего картирования виросферы и получения экологического и эволюционного понимания динамики взаимодействия конкретных фагов и хозяев.

Связывание вирусов с их хостами с помощью Digital PCR

Цифровая ПЦР

первоначально использовалась для количественного определения доли молекул ДНК с предопределенными мутациями в раковых клетках (Vogelstein and Kinzler, 1999). Вкратце, геномную ДНК разводят до исчезновения в микротитровальных планшетах (например, 96- или 384-луночных планшетах), так что отдельные матрицы могут быть отдельно амплифицированы с помощью ПЦР. Это позволяет обнаружить редкую мутантную матрицу из смеси с чувствительностью и точностью, превышающей ~ 2-кратные пределы обнаружения, возможные с помощью количественной ПЦР в реальном времени (Smith and Osborn, 2009; Baker, 2012).На основе измерения флуоресценции мутантный сигнал можно отличить от сигнала дикого типа по петлеобразной последовательности флуоресцентного зонда молекулярного маяка-RED (MB-RED, 5'-Cy3-олигонуклеотидный зонд-Dabcyl-3 '), который обнаруживает дикие продукты типа и мутантные по сравнению с зондом MB-GREEN (5'-флуоресцеин-олигонуклеотидный зонд-Dabcyl-3 '), который распознает только матрицу дикого типа, поскольку мутации препятствуют гибридизации зонда.

Применение микрофлюидной технологии улучшает цифровую ПЦР (Ottesen et al., 2006; Марси и др., 2007; Zare and Kim, 2010), позволяя проводить крупномасштабные исследования (например, выделять и анализировать отдельные клетки на 765-камерной панели массива ПЦР, где большинство камер не содержат или не содержат одну клетку; Рисунок 1A). В сочетании с секвенированием микрожидкостная цифровая ПЦР помогла выявить ассоциации фага и хозяина из образцов окружающей среды (например, задней кишки термитов; Tadmor et al., 2011), в частности, отвечая на два важных исследовательских вопроса в вирусной и микробной экологии: кто кого заражает и что процент определенных клеток-хозяев инфицирован определенным фагом.Прагматически ассоциация фаг-хозяин выявляется совместно локализованными флуоресцентными сигналами (FAM и HEX для фага и хозяина, соответственно). Продукты ПЦР консервативного гена фага (например, терминазы) гибридизуются с зондом, меченным FAM, в то время как продукты бактериального гена 16S рРНК связываются с зондом, меченным HEX. Наконец, фаг и хозяин могут быть идентифицированы путем секвенирования ДНК, извлеченной из камер массива ПЦР, с совместно локализованными сигналами.

РИСУНОК 1. Обзор процедур одноклеточных экспериментальных методов для изучения взаимодействий фаг-хозяин. (A) Для микрожидкостной цифровой ПЦР клетки сортируются на матричной панели с большинством камер, не содержащих или не содержащих одиночные клетки (адаптировано из Tadmor et al., 2011). Параллельная амплификация проводится как для фаговых, так и для бактериальных маркерных генов. Совместная локализация фаговых и бактериальных сигналов показана в каналах FAM и HEX, соответственно, с флуоресценцией в половине каждой камеры массива ПЦР. (B) Для фагаFISH образец фага-хозяина иммобилизован на 0.2 мкм фильтрующие мембраны или прикрепленные к положительно заряженным предметным стеклам (адаптировано из Allers et al., 2013). Ген бактериального маркера (16S рРНК) обнаруживается олигозондами, конъюгированными с молекулами пероксидазы хрена (HRP), которые катализируют отложение многих флуоресцентно меченых тирамидов (например, зеленого Alexa 488 ). Затем маркерный ген фага выявляется набором зондов двухцепочечной ДНК (6–12), меченных молекулами дигоксигенина (DIG). Затем DIG распознается антителом, меченным молекулой HRP, чтобы катализировать отложение многих флуоресцентно меченных тирамидов (например,г., красный Алекса 595 ).

Важнейшим шагом в применении микрофлюидной цифровой ПЦР к другим системам является разработка соответствующих праймеров. В работе с термитами в задней части кишечника (Tadmor et al., 2011) универсальные праймеры 16S рРНК и праймеры терминаз использовали для идентификации хозяина и фага соответственно. Новые наборы праймеров могут быть разработаны путем анализа наборов метагеномных данных (например, с использованием Metagenome Cluster Analysis Tool; Tadmor et al., 2011) для выявления генов-маркеров, специфичных для клонов, для конкретных вирусных и микробных мишеней.Программа CODEHOP (Rose et al., 2003) может затем исследовать области маркерных генов для создания праймеров с минимальной вырожденностью и димеров праймеров, а также профилей температуры плавления, аналогичных профилям универсального набора праймеров бактериальной рРНК, чтобы обеспечить коамплификацию. Затем несколько наборов разработанных праймеров тестируются экспериментально для оптимизации производительности амплификации и предела обнаружения (например, <100 копий гена; Tadmor et al., 2011).

Существует несколько проблем при связывании вирусов с их хозяевами с помощью микрофлюидной цифровой ПЦР.Во-первых, ложноположительные сигналы могут происходить от множества фаговых генов, высвобождаемых из преждевременно лизированных клеток, множества бактериальных генов 16S рРНК из клеток, прикрепленных к одной и той же камере, или флуоресцентного сигнала, выходящего из соседних камер (Tadmor et al., 2011). Эти проблемы можно обойти, исключив камеры с множественными бактериальными и / или вирусными сигналами, что, в частности, исключает сопутствующие инфекции, частота которых в значительной степени неизвестна, и рассматривая только камеры, окруженные камерами без флуоресценции в обоих каналах.В качестве альтернативы можно применить стратегию штрих-кодирования, чтобы индивидуальная матрица ДНК могла быть помечена уникальным штрих-кодом, амплифицирована и считана путем секвенирования (Kinde et al., 2011). Во-вторых, 765-камерная матричная панель для ПЦР, хотя и уже значительно увеличила производительность, по-прежнему, вероятно, является лишь крошечной подвыборкой естественного разнообразия. Одним из путей продвижения вперед могло бы стать применение капельной стратегии (Hindson et al., 2011; Jones et al., 2014) для сортировки клеток на капли нанолитрового размера (QX100 / QX200 Droplet Digital PCR System, Bio-Rad), где можно было бы использовать ПЦР. происходят в масштабах от 10 до 1000 реакций при использовании автоматизированных жидкостных систем.Такие шкалы данных позволят исследователям исследовать конкретные пары фаг-хозяин с очень небольшой фракцией клеток и / или фагов в образцах окружающей среды.

Связывание и визуализация взаимодействий фаг-хозяин с помощью флуоресценции In situ Гибридизация

Альтернатива цифровым методам ПЦР, флуоресцентные методы in situ гибридизации (FISH) дают возможность исследовать специфические взаимодействия фага с хозяином. GeneFISH (Moraru et al., 2010) изначально был разработан для обнаружения генов клеточных маркеров на уровне отдельных клеток.Вкратце, микробные сообщества собирают (например, на мембранных фильтрах 0,2 мкм или положительно заряженных предметных стеклах), а затем вводят зонды для нацеливания на ген бактериального маркера (например, 16s рРНК) и биогеохимически значимый ген. Молекулы пероксидазы хрена (HRP), связанные с зондами, катализируют осаждение многих флуоресцентно меченых тирамидов, так что обе генные мишени представлены разными флуоресцентными сигналами (например, зеленым Alexa 488 и красным Alexa 595 ), что снова делает возможной совместную работу с микроскопом. -локализация отдельных генных мишеней.Здесь ставилась цель найти микробных «хозяев» биогеохимически важных генов из образцов сложных сообществ.

Основываясь на этих открытиях, phageFISH (Allers et al., 2013) был разработан для более чувствительного нацеливания на маркерные гены как клеток, так и их инфицирующих фагов. Он улучшил предыдущие методы на основе генов FISH и FISH (Hoshino and Schramm, 2010; Kawakami et al., 2010; Moraru et al., 2010) за счет увеличения эффективности обнаружения фаговых генов с менее чем 40% до 98% за счет использования большего количества зондов. (до 12 зондов, ∼300 пар оснований каждый), чтобы обеспечить обнаружение одной копии гена фага в клетке.Хотя длинные зонды (~ 800 п.н.) использовались для достижения аналогичной эффективности обнаружения (Kawakami et al., 2012), специфичность связывания для встречающихся в естественных условиях фаговых мишеней может быть затронута из-за высокой генетической изменчивости, когда такие длинные участки консервации встречаются редко. Эта высокая чувствительность позволяет phageFISH измерять динамику инфекции (рис. 1B) от ранней (одна фаговая матрица) до поздней / взрывной стадии (несколько фаговых матриц инкапсулированы и разложены), как продемонстрировано в системе модели морской подовирус – гаммапротеобактериальный хозяин (Allers et al., 2013). Такие измерения неоценимы для различения литических, лизогенных и хронических форм фаговой инфекции (рис. 2), и phageFISH - единственный доступный метод, позволяющий сделать это без генетических факторов.

РИСУНОК 2. Возможное применение phageFISH для определения способов заражения. С течением времени инфекции фаги могут быть обнаружены как литические (например, рассеивание фагового сигнала вместе со снижением / потерей бактериального сигнала), хронические (например, постепенное усиление фагового сигнала вместе с отсутствием снижения / потери бактериального сигнала). сигнал) или лизогенный (например,g., без изменения фагового сигнала). Интенсивность фагового сигнала (красный) останется постоянной для лизогенных инфекций, в то время как она значительно возрастет для литических инфекций и в меньшей степени для хронических инфекций. Бактериальный сигнал (зеленый) со временем будет уменьшаться при литической инфекции в результате лизиса клеток и высвобождения фагового потомства, тогда как он должен оставаться неизменным при хронических инфекциях из-за производства потомства, медленно измельчаемого без нарушения целостности клеточной мембраны.Таким образом, сигналы двойного мечения могут помочь различить три режима фаговой инфекции на уровне одной клетки.

Для модельных систем с одним фагом и хозяином создание наборов зондов несложно с идентификацией 6–12 участков гена с одинаковым% G + C и длиной для достижения температур плавления, которые находятся в диапазоне не более 1–2 ° C. Однако для образцов окружающей среды требуется биоинформатика для определения подходящих областей сохранения, поскольку даже основные ортологичные гены вирусов могут быть идентичны <40% для 21 из 57 протестированных вирусных таксонов (Kristensen et al., 2013). Растущие наборы вирусных метагеномных данных [например, виромы из морской воды (Hurwitz and Sullivan, 2013), пресной воды (Roux et al., 2012), морских отложений (Breitbart et al., 2004; Yoshida et al., 2013) и кишечника человека ( Waller et al., 2014)] должны по крайней мере предоставить данные о последовательности для идентификации высококонсервативных фаговых генов-мишеней, подходящих для конструкции зонда phageFISH. Также хорошо изученные группы фагов, такие как T4-подобные миовирусы (Sullivan et al., 2010; Deng et al., 2014) и T7-подобные подовирусы (Labrie et al., 2013), для которых уже определены «ядерные геномы», предлагают основные исходные материалы для разработки и применения зонда phageFISH.С практической точки зрения, зонды должны нацеливаться на все представляющие интерес фаги с не более чем 5% несоответствий, чтобы быть эффективными (Moraru et al., 2010), что требует рассмотрения соответствующих подгрупп для нацеливания.

Помимо проблем, связанных с конструкцией зонда, использование этапа каталитического осаждения репортера (CARD) ограничивает phageFISH в лучшем случае «относительной количественной оценкой». В частности, phageFISH не может абсолютно количественно определять фаговые мишени в клетках, где молекулы тирозина, находящиеся в непосредственной близости от связанных с мишенью зондов, становятся ограниченными.Чтобы получить абсолютную количественную оценку сигнала фага каждой клетки, этап CARD необходимо исключить, возможно, заменить микроскопией сверхвысокого разрешения, чтобы обеспечить чувствительное обнаружение сигнала (Huang et al., 2010; Schermelleh et al., 2010; Vaughan et al. , 2012). Наконец, phageFISH в настоящее время имеет относительно низкую пропускную способность, поскольку одновременно можно обрабатывать только ограниченное количество образцов на мембранных фильтрах или положительных предметных стеклах. Для увеличения производительности, особенно для экспериментов, сравнивающих заражение одним фагом на нескольких хозяевах или разными фагами на одном и том же хозяине, образцы phageFISH могут быть приготовлены в формате 96- или 384-луночного планшета и проанализированы с помощью автоматизированной системы визуализации.

Заключение

Эти три появляющихся метода позволяют в будущих исследованиях изучить взаимодействие фага-хозяина на уровне отдельной клетки с особыми преимуществами в доступе к некультивируемым парам фаг-хозяин в природе. Извлечение вирусного сигнала из быстро растущих наборов данных SAG предлагает высокопроизводительный информационный подход для идентификации пар фаг-хозяин и умеренных фагов, а также для оценки частоты инфицирования микробных популяций. В дополнение к этому цифровая ПЦР и phageFISH используют отслеживание гена маркера разрешения одной клетки для конкретных пар фаг-хозяин в пространстве и времени с большим потенциалом для высокопроизводительной адаптации, которая позволит более быстрый скрининг и крупномасштабное экспериментальное отслеживание.В то время как микрофлюидная цифровая ПЦР, вероятно, имеет более непосредственную высокую пропускную способность, phageFISH предлагает единственную возможность различать стратегии заражения (например, литическая, хроническая, лизогенная) посредством динамических измерений отдельных клеток. Чтобы лучше понять динамику конкретных вирусных генов или функцию любых кодируемых вирусами генов, необходимы исследования экспрессии генов или белков в ходе инфекции (например, Lindell et al., 2007; Dammeyer et al., 2008; Thompson et al. , 2011). Вместе эти и другие достижения виромики (например,г., Andrews-Pfannkoch et al., 2010; Джон и др., 2011; Duhaime et al., 2012; Hurwitz et al., 2013a; Culley et al., 2014), информатики (например, Jiang et al., 2012; Albertsen et al., 2013; Gagic et al., 2014; Hurwitz et al., 2014) и теории (например, Beckett and Williams, 2013; Weitz et al., 2013; Soffer et al., 2014; Thingstad et al., 2014) трансформируют нашу способность исследовать естественные вирусные сообщества на уровне отдельных клеток и всей популяции и все больше и больше у их хозяев. Хотя данный обзор посвящен фагам, соответствующие архейные хозяева и их вирусы также могут быть исследованы с использованием этих методов.Эти достижения должны помочь вирусологам и микробам-экологам начать разработку моделей прогнозирования для этих важнейших экологических и эволюционных винтиков в природных экосистемах.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим наших коллег Мию Брейтбарт, Салли Чисхолм, Морин Коулман, Джеда Фурмана, Стивена Халлама, Филипа Хугенхольца, Дебби Линделл, Фореста Роуэра, Грига Стюарда, Джошуа Вейца, Марка Янга и членов лаборатории TMPL за годы активного обсуждения вирусной экологии. методы.Эта публикация частично финансируется Фондом Гордона и Бетти Мур, грантами GBMF2631, GBMF3305 и GBMF3790 Мэтью Б. Салливану.

Список литературы

Альбертсен, М., Хугенгольц, П., Скаршевски, А., Нильсен, К. Л., Тайсон, Г. У., и Нильсен, П. Х. (2013). Последовательности генома редких, некультивируемых бактерий, полученные путем объединения нескольких метагеномов с дифференцированным охватом. Нац. Biotechnol. 31, 533–538. DOI: 10.1038 / NBT.2579

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аллерс, Э., Moraru, C., Duhaime, M., Beneze, E., Solonenko, N., Barrero-Canosa, J., et al. (2013). Динамика вирусной инфекции на одноклеточном и популяционном уровне выявляется с помощью фагаFISH - метода визуализации внутриклеточных и свободных вирусов. Environ. Microbiol. 15: 2306. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12100

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анантараман К., Духейм М. Б., Брейер Дж. А., Вендт К. А., Тонер Б. М. и Дик Г. Дж. (2014). Гены окисления серы у разнообразных глубоководных вирусов. Наука 344, 757–760. DOI: 10.1126 / science.1252229

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андерсон, Р. Э., Бразелтон, У. Дж., И Баросс, Дж. А. (2011b). Использование CRISPR в качестве метагеномного инструмента для идентификации микробных хозяев диффузного потока гидротермального сообщества вирусов. FEMS Microbiol. Ecol. 77, 120–133. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2011.01090.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эндрюс-Пфаннкоч, К., Фадрош, Д. В., Торп, Дж., И Уильямсон, С. Дж. (2010). Опосредованное гидроксиапатитом разделение геномов двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК и РНК от природных вирусных сообществ. заявл. Environ. Microb. 76, 5039–5045. DOI: 10.1128 / AEM.00204-10

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брейтбарт, М., Фелтс, Б., Келли, С., Махаффи, Дж. М., Нултон, Дж., Саламон, П. и др. (2004). Разнообразие и популяционная структура прибрежного морского вирусного сообщества. Proc. Биол. Sci. 271, 565–574. DOI: 10.1098 / rspb.2003.2628

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брейтбарт М., Томпсон Л. Р., Саттл С. С. и Салливан М. Б. (2007). Изучение огромного разнообразия морских вирусов. Океанография 20, 353–362. DOI: 10.5670 / oceanog.2007.58

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Броуди, Т. Б., и Фишетти, В. А. (2003). Лизогенное преобразование Tox- Streptococcus pyogenes в Tox + с помощью лизогенных Streptococci или свободного фага in vivo. Заражение. Иммун. 71, 3782–3786. DOI: 10.1128 / IAI.71.7.3782-3786.2003

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канчая, К., Про, К., Фурнус, Г., Бруттин, А., и Брюссов, Х. (2003). Геномика профагов. Microbiol. Мол. Биол. R. 67, 238–276. DOI: 10.1128 / MMBR.67.2.238-276.2003

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каталао, М. Дж., Гил, Ф., Мониш-Перейра, Дж., Сан-Жозе, К., и Пиментел, М. (2013). Разнообразие систем бактериального лизиса: бактериофаги указывают путь. FEMS Microbiol. Ред. 37, 554–571. DOI: 10.1111 / 1574-6976.12006

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ceyssens, P.-J., Brabban, A., Rogge, L., Lewis, M.S., Pickard, D., Goulding, D., et al. (2010). Молекулярно-физиологический анализ трех фагов Pseudomonas aeruginosa , относящихся к «N4-подобным вирусам». Вирусология 405, 26–30. DOI: 10.1016 / j.virol.2010.06.011

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калли, А.И., Мюллер, Дж. А., Белкейд, М., Вуд-Чарлсон, Э. М., Пуассон, Г., и Стюард, Г. Ф. (2014). Характеристика РНК-вирусов в тропической морской воде с использованием целевой ПЦР и метагеномики. мБио 5, e01210 – e01214. DOI: 10.1128 / mBio.01210-14

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Даммайер, Т., Бэгби, С. К., Салливан, М. Б., Чизхолм, С. В., и Франкенберг-Динкель, Н. (2008). Эффективный фаговый биосинтез пигментов океанических цианобактерий. Curr. Биол. 18, 442–448. DOI: 10.1016 / j.cub.2008.02.067

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвис, Б. М., Кимси, Х. Х., Чанг, В. и Уолдор, М. К. (1999). Бактериофаг калькутты Vibrio cholerae O139 CTXφ является инфекционным и кодирует новый репрессор. J. Bacteriol. 181, 6779–6787.

Google Scholar

Денг, Л., Грегори, А., Йилмаз, С., Поулос, Б., Гугенгольц, П.и Салливан М. (2012). Противопоставление жизненных стратегий вирусов, инфицирующих фото- и гетеротрофные бактерии, выявленное с помощью вирусной маркировки. мBio 3, e00516 – e00512. DOI: 10.1128 / mBio.00516-12

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Deng, L., Ignacio-Espinoza, J. C., Gregory, A. C., Poulos, B. T., Weitz, J. S., Hugenholtz, P., et al. (2014). Мечение вирусов выявляет дискретные популяции в пространстве последовательностей вируса Synechococcus . Природа 513, 242–245. DOI: 10.1038 / природа13459

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Диас-Муньос, С. Л., и Коскелла, Б. (2014). «Взаимодействие бактерий и фагов в естественной среде», в Advances in Applied Microbiology , ред. С. Сима и Дж. Джеффри (Майкл, Миннесота: Academic Press), 135–183.

Google Scholar

Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., and Sullivan, M. B. (2012). К количественной метагеномике диких вирусов и других образцов ДНК сверхнизкой концентрации: тщательная оценка и оптимизация метода амплификации линкера. Environ. Microbiol. 14, 2526–2537. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2012.02791.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фогг, П.С.М., Хайнс, А.П., Дигби, Э., Ланг, А.С. и Битти, Дж. Т. (2011). Характеристика недавно открытого Mu-подобного бактериофага, RcapMu, в штамме Rhodobacter capsulatus SB1003. Вирусология 421, 211–221. DOI: 10.1016 / j.virol.2011.09.028

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гагич, Д., Маклин, П. Х., Ли, Д., Аттвуд, Г. Т., и Мун, К. Д. (2014). Улучшение генетической представленности редких таксонов в сложных микробных сообществах с помощью методов нормализации ДНК. Мол. Ecol. Ресурс. (Предварительная онлайн-публикация). DOI: 10.1111 / 1755-0998.12321

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хиндсон, Б. Дж., Несс, К. Д., Маскелье, Д. А., Белградер, П., Эредиа, Н. Дж., Макаревич, А. Дж. И др. (2011). Высокопроизводительная система цифровой ПЦР по каплям для абсолютного количественного определения количества копий ДНК. Анал. Chem. 83, 8604–8610. DOI: 10.1021 / ac202028g

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холмфельдт, К., Ховард-Варона, К., Солоненко, Н., Салливан, М. Б. (2014). Противопоставление геномных паттернов и стратегий заражения двух сосуществующих родов Bacteroidetes podovirus. Environ. Microbiol. 16, 2501–2513. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12391

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хольмфельдт, К., Солоненко, Н., Шах, М., Корриер, К., Риман, Л., Верберкмоес, Н. К. и др. (2013). Двенадцать ранее неизвестных родов фагов повсеместно распространены в мировом океане. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 12798–12803. DOI: 10.1073 / pnas.1305956110

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хошино, Т., и Шрамм, А. (2010). Обнаружение генов денитрификации путем in situ амплификации-флуоресценции in situ гибридизации для связывания метаболического потенциала с идентичностью внутри бактериальных клеток. Environ. Microbiol. 12, 2508–2517. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2010.02224.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гурвиц, Б. Л., Денг, Л., Поулос, Б. Т., и Салливан, М. Б. (2013a). Оценка методов концентрации и очистки сообществ океанических вирусов с помощью сравнительной воспроизводимой метагеномики. Environ. Microbiol. 15, 1428–1440. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2012.02836.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гурвиц, Б.Л., Вествелд, А. Х., Брам, Дж. Р., Салливан, М. Б. (2014). Моделирование экологических факторов в морских вирусных сообществах с использованием сравнительной метагеномики и сетевого анализа. Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 10714–10719. DOI: 10.1073 / pnas.1319778111

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян, Б., Сун, К., Рен, Дж., Дэн, М., Сунь, Ф., и Чжан, X. (2012). Сравнение метагеномных образцов с использованием сигнатур последовательностей. BMC Genom. 13: 730. DOI: 10.1186 / 1471-2164-13-730

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джон, С. Г., Мендес, К. Б., Денг, Л., Поулос, Б., Кауфман, А. К. М., Керн, С. и др. (2011). Простой и эффективный метод концентрации океанических вирусов путем химической флокуляции. Environ. Microbiol. Реп. 3, 195–202. DOI: 10.1111 / j.1758-2229.2010.00208.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, М., Уильямс, Дж., Гертнер, К., Филлипс, Р., Херст, Дж., И Фратер, Дж. (2014). Обнаружение цели с низким числом копий с помощью Droplet Digital PCR за счет применения нового биоинформатического конвейера с открытым доступом, «Definetherain». J. Virol. Методы 202, 46–53. DOI: 10.1016 / j.jviromet.2014.02.020

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джовер, Л. Ф., Эгер, Т. К., Бьюкен, А., Вильгельм, С. В., и Вайц, Дж. С. (2014). Элементный состав вирусных частиц: последствия для морских биогеохимических циклов. Нац. Rev. Microbiol. 12, 519–528. DOI: 10.1038 / nrmicro3289

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каваками, С., Хасегава, Т., Имачи, Х., Ямагути, Т., Харада, Х., Охаши, А., и др. (2012). Обнаружение однокопийных функциональных генов в прокариотических клетках с помощью двухпроходного TSA-FISH с полинуклеотидными зондами. J. Microbiol. Методы 88, 218–223. DOI: 10.1016 / j.mimet.2011.11.014

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каваками, С., Кубота, К., Имачи, Х., Ямагути, Т., Харада, Х., и Охаши, А. (2010). Обнаружение одиночных копий генов с помощью двухпроходной флуоресценции с амплификацией тирамидного сигнала in situ гибридизацией (двухпроходный TSA-FISH) с одиночными олигонуклеотидными зондами. Microbes Environ. 25, 15–21. DOI: 10.1264 / jsme2.ME09180

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кинде И., Ву Дж., Пападопулос Н., Кинзлер К. В. и Фогельштейн Б. (2011). Обнаружение и количественная оценка редких мутаций с массовым параллельным секвенированием. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108, 9530–9535. DOI: 10.1073 / pnas.1105422108

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кристенсен, Д. М., Валлер, А. С., Ямада, Т., Борк, П., Мушегян, А. Р., Кунин, Э. В. (2013). Кластеры ортологичных генов и гены-сигнатуры таксонов для вирусов прокариот. J. Bacteriol. 195, 941–950. DOI: 10.1128 / jb.01801-12

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лабри, С.J., Frois-Moniz, K., Osburne, M. S., Kelly, L., Roggensack, S. E., Sullivan, M. B., et al. (2013). Геномы морских цианоподовирусов обнаруживают множественное происхождение разнообразия. Environ. Microbiol. 15, 1356–1376. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12053

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линделл Д., Джаффе Дж. Д., Коулман М. Л., Футчик М. Э., Аксманн И. М., Ректор Т. и др. (2007). Полногеномная динамика экспрессии морского вируса и хозяина обнаруживает особенности совместной эволюции. Природа 449, 83–86. DOI: 10.1038 / nature06130

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линделл Д., Салливан М. Б., Джонсон З. И., Толонен А. К., Ровер Ф. и Чисхолм С. В. (2004). Перенос генов фотосинтеза в вирусы Prochlorococcus и обратно. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101, 11013–11018. DOI: 10.1073 / pnas.0401526101

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Литтл, Дж.W. (2005). «Лизогения, индукция профага и лизогенная конверсия», в «Фаги, их роль в бактериальном патогенезе и биотехнологии» , ред. М. К. Уолдор, Д. И. Фридман и С. Адхья (Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press), 37–54.

.Выделение

и физиоморфологическая характеристика Escherichia coli. O157: H7-инфицированные бактериофаги, полученные из мясного скота.

Бактериофаги, выделенные из среды мясного скота и специально нацеленные на Escherichia coli O157: H7, были исследованы на их физиологические и морфологические характеристики. Степень бактериального лизиса и диапазон выделенных бактериофагов-хозяев определяли в отношении 55 изолятов E. coli O157: H7. Морфологию фагов изучали под просвечивающим электронным микроскопом.Также были определены параметры роста фага, в частности скорость адсорбции, период роста, латентный период и размер всплеска. Стабильность выделенных фагов проверяли при кислом и щелочном pH, при высоких температурах и при хранении в холодильнике. Всего было выделено 7 фагов, которые проявили литическую активность против 50 из 55 изолятов E. coli O157: H7. По морфологии фаги были отнесены к семейству Myoviridae или Siphoviridae. Фаги имели период подъема от 19 до 40 минут, короткий латентный период от 12 до 30 минут и большой размер всплеска (89–631 вириона на инфицированную клетку), что указывает на высокую литическую активность.Фаги оставались стабильными в течение 24 часов при широком диапазоне pH (1–11) и температур (40–60 ° C) и в течение 90 дней при хранении в холодильнике. Характеристика бактериофагов с разнообразным диапазоном хозяев: E. coli, O157: H7, может помочь в разработке эффективных стратегий биологической борьбы с этим патогеном в пищевой промышленности.

1. Введение

Escherichia coli O157: H7 - важный патоген пищевого происхождения, который обитает в рубце крупного рогатого скота и других пищевых животных, таких как овцы и козы [1–5].Кроме того, олени, лошади, собаки и птицы также могут временно являться носителями этого патогена [4, 6–8]. Прямой или косвенный контакт с животными или навозом животных, являющихся носителями E. coli O157: H7, может опосредовать его перенос в воду и пищевые продукты, что может привести к инфицированию человека при употреблении. В типичный год в Соединенных Штатах (США) E. coli O157: H7 вызывает примерно 63 000 болезней пищевого происхождения, 2100 госпитализаций и 20 смертей, что оборачивается экономическим бременем в 271 миллион долларов [9, 10].На поздних стадиях патогенной инфекции геморрагический колит может перерасти в гемолитико-уремический синдром. Тяжелые осложнения характеризуются почечной недостаточностью, гемолитической анемией и тромбоцитопенией, которые могут привести к летальному исходу [11–13]. Некоторые продукты питания высокого риска, связанные с этими заболеваниями, включают говядину и мясные продукты, свежие продукты, непастеризованный яблочный сок и молочные продукты [13–28].

Уменьшение количества E. coli O157: H7 на этапе до сбора урожая и обработки может сыграть значительную роль в предотвращении проникновения этого патогена в пищевую цепь.Различные подходы, такие как диета и терапия пробиотиками, вакцинация и антибиотики, против E. coli O157: H7 были оценены для контроля его распространенности у сельскохозяйственных животных [3, 10, 29]. Однако повторное заселение ранее инфицированных животных одними и теми же или разными штаммами E. coli O157: H7 ограничивает эффективность этих стратегий [3, 30]. Точно так же на уровне обработки для борьбы с E. были использованы различные меры контроля, такие как органические кислоты, хлор или другие противомикробные промывки.coli O157: H7 в пищевых продуктах [31–34]. Однако эти меры остаются недостаточными, о чем свидетельствуют продолжающиеся вспышки болезней пищевого происхождения и отзывы продуктов питания, связанные с этим патогеном. Поэтому важно разработать эффективные альтернативы для борьбы с E. coli O157: H7 в пищевой и животноводческой промышленности.

Целевое использование бактериофагов против E. coli O157: H7 могло бы уменьшить эту проблему. Бактериофаги - это широко распространенные в природе вирусы, которые поражают определенные бактерии и убивают их.Они признаны комменсальными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и были выделены из различных источников [35, 36]. Почти столетие назад д’Эрелль [37] продемонстрировал эффективность бактериофагов против патогенов человека. Однако в последнее время в связи с появлением устойчивых к антибиотикам микроорганизмов давно утраченная фаговая терапия вновь обрела интерес к использованию против патогенов пищевого происхождения. В условиях in vitro вирулентные бактериофаги продемонстрировали способность к селективной элиминации E.coli O157: H7 [38, 39]. Кроме того, исследования на овцах показали, что колонизацию кишечника E. coli O157: H7 можно предотвратить пероральным введением фагов, инфицирующих O157: H7 [39]. Эффективность бактериофагов против E. coli O157: H7 также была зарегистрирована в различных пищевых продуктах, таких как дыня, шпинат, салат, помидоры, брокколи и говяжий фарш [40–42]. В исследовании O’Flynn et al. [43] коктейль из E. coli O157: H7-специфических бактериофагов полностью снизил количество патогенов на поверхности говяжьих стейков.Кроме того, исследования показали, что фаги могут эффективно уничтожать E. coli O157: H7 в биопленках на различных поверхностях пищевой промышленности, таких как нержавеющая сталь и полиэтилен высокой плотности [42, 44]. Несмотря на то, что исследования продемонстрировали потенциал технологий на основе фагов для борьбы с E. coli O157: H7, очень мало известно о морфологии, физиологии и характеристиках конкретных фагов. В то же время выбор эффективных бактериофагов для применения в пищевой и животноводческой промышленности также требует понимания их выживаемости в различных стрессовых условиях.Настоящее исследование было направлено на выделение E. coli O157: H7-специфических бактериофагов из мясного скота и определение их физиоморфологических характеристик, включая выживаемость при различных pH, высоких температурах и условиях хранения в холодильнике.

2. Материалы и методы
2.1. Бактериальные культуры

Выделение бактериофагов проводили с использованием штамма-хозяина, E. coli O157: H7 ATCC 43895 (таблица 1). Диапазон хозяев выделенных фагов определяли с использованием 55 E.coli O157: H7 (таблица 1). Два из этих изолятов были клиническими штаммами (ATCC 43895, ATCC 43888), а остальные были изолятами дикого типа (WT), извлеченными из нашей коллекции лабораторных культур, первоначально выделенными из фекалий крупного рогатого скота или из окружающей среды фермы крупного рогатого скота [45]. Перед экспериментом ночную культуру каждого изолята E. coli O157: H7 из готовили в триптическом соевом бульоне (TSB; Bacto ™, BD, Sparks, MD) и инкубировали статически при 37 ° C в течение 18 часов.

90 068 +++

Штаммы P-1 P-2 P-3 P-4 P-5 P-6 P-7

ATCC 43895 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
ATCC 43888 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF2 +++ +++ ++ + +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF3 +++ +++ +++ +++ +++ 9 0073 +++ +++
O157: H7 RF4 +++ +++ +++ +++ +++ - ++ +
O157: H7 RF5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF6 - - - - - - -
O157: H7 RF7 - - - - - - -
O157: H7 RF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157 : H7 RF9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF11 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF13 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF14 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + +++
O157: H7 RF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF2 +++ +++ +++ +++ + ++ +++ +++
O157: H7 SF4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF10 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF14 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 SW3 - - - - - - -
O157: H7 TW3 - - - - - - -
O157: H7 TE1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
O157: H7 TE2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF2 +++ +++ +++ +++ ++ + +++ +++
O157: H7 TF3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF8 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF11 + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF12 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF13 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 TF14 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 RF15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 XW5 +++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 JF4 +++ +++ - - +++ - +++
O157: H7 LF4 +++ +++ +++ +++ +++ + ++ +++
O157: H7 KF10 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 JEQ1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 JF6 +++ +++ ++ + +++ +++ +++ +++
O157: H7 KF7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O157: H7 LF5 +++ +++ +++ +++ +++ + ++ +++
O157: H7 EF2 - - - - - - -

на По степени прозрачности бактериального газона пятна были разделены на три категории: прозрачные (+++), мутные (++) или без реакции (-).
2.2. Выделение бактериофагов

В течение двух лет образцы воды () и бычьих фекалий () были собраны в течение летних месяцев от мясного скотоводства в Оклахоме и использованы для выделения бактериофагов, специфичных для E. coli O157: H7 [45]. Образцы воды (10 мл) и фекалий (10 г) были обогащены 25 мл бульона из дрожжевого экстракта NZ-амин казаминокислых дрожжей двойной концентрации хлорида натрия, магния (NZCYM; RPI Corp, IL) в течение 18 ч при 37 ° C вместе с 10 мл. мл бактериальной культуры хозяина ( E.coli O157: H7 ATCC 43895). После инкубации 2 мл суспензии центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса и фекального материала. Супернатант фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,45 µ (EMD Millipore Millex ™, Carrigtwohill, Ирландия) и фильтрат высевали на агар NZCYM (Fisher Scientific, NJ) методом двухслойного агара, как описано Sambrook et al. [46]. Присутствие фага подтверждалось образованием бляшек на чашке с агаром, и фаг дополнительно концентрировали способом, описанным Chandra et al.[47]. Вкратце, ночную культуру (100 мкл л) E. coli O157: H7 суспендировали в расплавленном (0,75%) агаре NZCYM и выливали на чашку с агаром NZCYM, которой давали затвердеть в течение 2–5 минут. Затем планшет наносили штрихами фага в виде горизонтальных и вертикальных линий, используя стерильную платиновую петлю, и инкубировали при 37 ° C в течение 18–20 часов. После инкубации 5 мл буфера SM (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl; 10 мМ MgSO 4 ; Fisher Scientific, NJ) выливали на чашки с агаром для элюирования любых бляшек вдоль линий.Затем с агара, содержащего бляшки, соскребали стерильную платиновую петлю, чтобы высвободить фаги, и элюцию центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 минут. Полученный супернатант фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,22 µ , к которому добавляли 0,1% хлороформа (Fisher Scientific, NJ), чтобы получить рабочий раствор фага, который хранили при 4 ° C до дальнейшего использования. Размер бляшек (мм) отдельных фагов определяли с помощью анализа бляшек [48] и измерения их диаметра с помощью штангенциркуля Vernier (Fisherbrand ™ Traceable ™ Digital Calipers, NJ).

Перед экспериментом определяли титры фагов (таблица 2) в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ) мл -1 , серийно разбавляя рабочий раствор фага в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH 7,4; хлорид натрия, Fisher Scientific, Нью-Джерси; хлорид калия, одноосновный фосфат натрия и двухосновный фосфат натрия, Sigma-Aldrich, Миссури), а также путем проведения анализа налета [48].


Фаги Титр (БФЕ, мл −1 ) Размер налета (мм)

P-1
П-2
П-3
П-4
П-5
П-6
П-7

2.3. Диапазон хозяев бактериофага

Диапазон хозяев всех фагов был протестирован против 55 изолятов E. coli O157: H7 (таблица 1) с использованием анализа «пятно на лужайке» [48]. Ночная культура (100 мкл л) каждого бактериального изолята была добавлена ​​к 5 мл расплавленного (0,75%) агара NZCYM и нанесена на чашку с агаром NZCYM. Десять микролитров соответствующего раствора фага (~ 10 8 БОЕ, мл -1 ) наносили на каждую чашку с бактериальным агаром. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 18 ч и исследовали на наличие чистых зон на бактериальном газоне, чтобы определить диапазон хозяев для соответствующих фагов.Чувствительность бактерий к бактериофагу устанавливали по бактериальному лизису в месте депонирования фага. В зависимости от степени прозрачности бактериального газона пятна были разделены на три категории: прозрачные (+++), мутные (++) или без реакции (-) (Таблица 1 и Рисунок 1).


2.4. Морфология бактериофага

Морфология фага определялась с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Образец был приготовлен суспендированием ночной культуры (100 мкл л) E.coli O157: H7 в 5 мл расплавленного (0,75%) агара NZCYM и выливали на чашку со свежим агаром NZCYM. Исходный фаг (полученный выше) серийно разводили в буфере SM с добавлением 1 М кальция (SM-Ca; Fisher Scientific, NJ). 10 мкл л каждого разведения наносили на чашку с бактериальным агаром (приготовленную выше) и инкубировали при 37 ° C в течение 18 часов. После инкубации фаги элюировали 10 мкл л SM-Ca путем осторожного пипетки вверх и вниз (7–10 раз) на перепончатое пятно. Каждый элюированный образец фага отрицательно окрашивали 2% -ной фосфорновольфрамовой кислотой (Emsdiasum, Hatfield, PA) на сетках с углеродным покрытием (Emsdiasum, Hatfield, PA) и исследовали под просвечивающим электронным микроскопом (TEM; JEM-2100TEM, JEOL).Морфологию (форму), диаметр капсида (нм) и длину хвоста (нм) фагов определяли с помощью электронных микрофотографий при увеличении 50,000x (Oklahoma Technology and Research Park Venture, Университет штата Оклахома, Стиллуотер, Оклахома-сити).

2,5. Стабильность бактериофагов при кислотном и щелочном pH, при высоких температурах и при хранении в холодильнике

Стабильность выделенных фагов тестировалась в широком диапазоне pH (1–11) и температуры (от -80 до 90 ° C), чтобы определить их выживаемость в кислой среде. , щелочные, высокотемпературные и холодные условия хранения.Все исследования стабильности фага проводились с популяцией фага примерно 10 8 БОЕ мл -1 (таблица 2).

Исследования стабильности в кислых и щелочных условиях были проведены в соответствии с методами, описанными Niu et al. [49]. Вкратце, фаги суспендировали в PBS с добавлением 1 М NaOH или HCl (Fisher Scientific, NJ), чтобы получить диапазон pH 1-11, и инкубировали при 37 ° C для определения их выживаемости при 1, 2, 4, 6, 12 и 24 ч.

Для термостабильности [50] рабочий запас каждого фага (100 мкл л) суспендировали в 900 мкл л PBS и суспензию инкубировали при 40, 60, 70 и 90 ° C в течение 60 минут в сухая ванна (Fisher Scientific, IA).Популяцию фагов при каждой температуре определяли каждые 10 мин в течение 60-минутной инкубации.

Для обеспечения стабильности при хранении в холодильнике [50] 1 мл исходного раствора каждого изолированного фага хранили при 4, –20 и –80 ° C и отбирали пробы через 0, 1, 30, 60 и 90 дней. Выжившие популяции фагов для каждого исследования определяли путем серийного разведения образцов в PBS и посева на агар NZCYM с использованием метода двухслойного агара.

2.6. Адсорбция фагов и одностадийная кинетика роста

Анализ адсорбции фагов [51] был проведен для определения времени, необходимого фагам для адсорбции на поверхности бактерий-хозяев.Их период нарастания и латентный период, а также размер их всплеска были определены посредством исследования кинетики одноэтапного роста. Ночную культуру (1 мл) хозяина E. coli O157: H7 (10 9 КОЕ мл, -1 ) центрифугировали при 12000 об / мин в течение 2 мин. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 900 мкл л PBS и 100 мкл л маточного раствора фага (10 8 БОЕ мл -1 ), добавленных к суспензии для достижения кратности 0,1 инфекция (MOI).Эту суспензию бактерий-фагов использовали для исследования адсорбции и одностадийной кинетики роста.

Для исследования адсорбции фага суспензию бактерий-фаг инкубировали при 37 ° C в течение 80 мин. После отбора начальной пробы при 0 мин, аликвоту 100 мкл л отбирали каждые 20 мин путем добавления 900 мкл л PBS и центрифугирования в течение 2 мин при 12000 об / мин. Супернатант, содержащий неадсорбированные фаги, фильтровали через фильтр 0,2 мкм и высевали, используя технику двухслойного агара.Процент неадсорбированных фагов в каждом 20-минутном интервале рассчитывали как отношение -1 БОЕ мл в супернатанте к исходному -1 БОЕ мл в 0 мин. Процент адсорбированных фагов определяли путем вычитания процента неадсорбированных фагов из 100.

Для одностадийного эксперимента по выращиванию суспензию бактерий-фагов инкубировали при 37 ° C в течение 10 минут, чтобы позволить фагам адсорбироваться на бактериальной клетке. [52]. После инкубации суспензию центрифугировали при 13000 об / мин в течение 1 мин и супернатант подвергали анализу бляшек для определения титра неадсорбированных фагов.Осадок, содержащий инфицированные бактериальные клетки, немедленно ресуспендировали в 10 мл предварительно нагретого (37 ° C) TSB и после взятия исходного образца (100 мкл л) в течение 0 минут инкубировали при 37 ° C в течение 60 минут. Для получения одноэтапной кривой роста каждые 5 минут собирали образец объемом 100 мкл, л, серийно разбавляли и высевали на агар NZCYM с использованием метода двухслойного агара. Период нарастания и латентный период, а также размер вспышки каждого фага были рассчитаны путем подгонки одноэтапной кривой роста в 4-параметрическую сигмоидальную модель [53] следующим образом:, где была логарифмическая плотность фага (БОЕ мл -1 ) в момент времени (мин), было исходной логарифмической плотностью фагов в момент времени 0 (мин), было периодом роста (мин), было логарифмической плотностью (БОЕ мл -1 ) вирионов на инфицированных клетки, и была максимальной скоростью экспоненциального роста фага (min -1 ).Размер пакета (ячейка -1 PFU) и латентный период (мин) рассчитывались как и соответственно. Латентный период определяли как временной интервал между концом адсорбции и началом первого всплеска (т.е. постоянный период), на который указывает минимальное увеличение титра фага [54, 55]. Период роста (после латентного периода) был определен как время, в течение которого инфицированные бактериальные клетки лизировались со значительным увеличением титра фага [54]. Размер взрыва определялся как максимальный выход фагов, полученный от появления первого фагового потомства до полного лизиса бактериальных клеток [48, 56].

2.7. Статистический анализ

Все эксперименты были повторены трижды, и были получены средние значения трех повторов. Выжившие популяции фагов, полученные в каждом исследовании, были преобразованы в log 10 БОЕ / мл -1 . Статистический анализ проводили для определения влияния pH и высокой температуры на выживаемость фагов. Данные были проанализированы для определения дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием теста множественных диапазонов Дункана (программное обеспечение JMP v.12; SAS Inst., Кэри, Северная Каролина, США). Значимые различия между результатами оценивались в.

3. Результаты
3.1. Выделение и определение диапазона хозяев бактериофагов

Из 127 протестированных образцов окружающей среды было выделено семь фагов, специфичных к E. coli O157: H7, которые обозначены как P-1 - P-7. Выделенные фаги образовывали прозрачные бляшки среднего размера (примерно 0,3–0,5 мм в диаметре) на лужайке бактерий-хозяев (таблица 2).

Диапазон хозяев выделенных фагов был определен против 55 E.coli O157: изоляты H7 (ATCC и WT). Все выделенные фаги образовывали светлые (+++) пятна на лужайке 49 (89%) изолятов E. coli O157: H7, что указывает на сильную литическую активность и широкий круг хозяев (таблица 1). Однако фаг P-6 не лизировал изоляты RF4 и JF4, а фаги P-3 и P-4 не лизировал изолят JF4. Все семь фагов образовывали мутные (++) пятна против изолята TE1 и не проявляли реакции (-) против изолятов WT EF2, RF6, RF7, SW3 и TW3 (таблица 1).

3.2. Морфология бактериофага

Электронные микрофотографии показали, что фаги P-1, P-2 и P-5 имели икосаэдрическую головку (около 89 нм в диаметре) и короткий сократительный хвост (ок.115 нм) с базовой пластиной и несколькими хвостовыми волокнами (рис. 2 (а)). Общая морфология показала, что эти фаги были Т4-подобными фагами, принадлежащими к семейству Myoviridae отряда Caudovirales. Фаги P-3, P-4, P-6 и P-7 имели шестиугольную головку (диаметр примерно 89 нм) с чрезвычайно длинным гибким хвостом (примерно 198 нм) и без видимых воротничков или концевых выступов (Рисунок 2 ( б)). Они были идентифицированы как фаги семейства Siphoviridae отряда Caudovirales.

3.3. Стабильность бактериофагов при кислотном и щелочном pH, при высоких температурах и при хранении в холодильнике

Все выделенные фаги тестировали в широком диапазоне pH (1–11) в течение 24 часов, чтобы определить их стабильность в кислой и щелочной среде. условия (рисунки 3 (а) и 3 (б)).В кислом диапазоне pH (1–5) фаги проявляли наибольшую стабильность при pH 5 с минимальной потерей жизнеспособности (0,1–1,7 log БОЕ, мл –1 ) через 2 часа инкубации. Из семи протестированных фагов три (P-2, P-5 и P-6) выжили при pH 1 в течение 24 часов с популяцией 4,4–5,9 log PFU мл −1 (Рисунок 3 ( а)), а Р-3 выживает при pH 1 в течение 1 ч. Все фаги выживали при pH 2 в течение 24 часов с ограниченной потерей активности (0,2–3,7 log БОЕ мл –1 ) через 1 час инкубации (рис. 3 (а)).Среди всех фагов P-3 был наиболее стабильным при pH 2 без существенной () потери жизнеспособности (0,9 log БОЕ мл -1 ) после 24 часов инкубации. Все фаги хорошо выживали при pH 7 и 9 без значительной () потери жизнеспособности (0,1–1,9 log БОЕ мл –1 ) через 24 часа инкубации (рис. 3 (b)). Фаги также были стабильны при pH 11 до 12 часов и имели минимальное снижение (0,8–2,3 log БОЕ мл –1 ) в титрах после 24 часов инкубации (рис. 3 (b)). Среди всех семи фагов P-7 был наиболее стабильным при pH 11 с небольшим сокращением популяции (0.4–1,6 БОЕ мл –1 ) в течение 24 часов.


(а) Стабильность фагов при кислом pH (1, 2, 5) в течение 24 часов. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Данные были проанализированы на уровне значимости
(б) Стабильность фагов при щелочном pH (7, 9, 11) в течение 24 часов. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Данные были проанализированы на уровне значимости
(а) Стабильность фагов при кислом pH (1, 2, 5) в течение 24 часов.Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Данные были проанализированы на уровне значимости
(б) Стабильность фагов при щелочном pH (7, 9, 11) в течение 24 часов. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Данные были проанализированы на уровне значимости

. Результаты исследований термостабильности показали, что все протестированные фаги были стабильны в диапазоне температур 40–60 ° C и не утратили жизнеспособность после 60 минут инкубации при соответствующих температурах (рис. (а) и 4 (б)).На жизнеспособность фагов существенно () влияли более высокие температуры 70 и 90 ° C (Рисунки 4 (c) и 4 (d)). При 70 ° C популяции фагов P-5 и P-7 были уменьшены на 2,5 и 3,3 log БОЕ мл -1 , соответственно, после 10 мин инкубации. Фаги P-3, P-4 и P-6 показали сокращение популяции между 6,4 и 7,3 log БОЕ / мл -1 , тогда как фаги P-1 и P-2 не показали жизнеспособности через 10 мин. Все остальные фаги потеряли жизнеспособность после 20 мин инкубации при 70 ° C (рис. 4 (c)).При 90 ° C жизнеспособные фаги не были обнаружены после 10 мин инкубации (рис. 4 (d)).

Фаги также были протестированы на стабильность при хранении в холодильнике, и было установлено, что они более стабильны при температуре охлаждения (4 ° C), чем при температурах заморозки (-20 и -80 ° C) в течение 90 дней (Рисунки 5 (а), 5 (б) и 5 ​​(в)). При 4 ° C минимальное сокращение популяций фагов (0,1–2,3 log БОЕ мл –1 ) наблюдалось в течение 90 дней. Фаги P-6 и P-7 были наиболее стабильными, с незначительной (0,6 log БОЕ мл -1 ) потерей титров во время 90-дневного хранения (рис. 5 (а)).При -20 ° C, все фаги были стабильны в день 1 с небольшим уменьшением (0,6–2,1 log БОЕ мл -1 ) в популяции (рис. 5 (b)). Фаги P-3, P-4 и P-6 сохраняли свои титры в течение 90-дневного периода. Другие фаги показали уменьшение популяции (4,0–6,3 log БОЕ мл -1 ), но сохранили свою жизнеспособность в течение 90 дней (рис. 5 (b)). Фаги P-1, P-2 и P-5 показали лучшую выживаемость при -80 ° C, чем при -20 ° C. Все остальные фаги показали уменьшение своей популяции (между 2.0 и 5,1 log БОЕ мл -1 ) после 90-дневного хранения (рисунок 5 (c)). По сравнению с другими фагами, P-6 был наиболее стабильным при всех температурах холодного хранения с небольшим уменьшением (0,6–2,0 log БОЕ мл –1 ) популяции после 90-дневного хранения.

3.4. Адсорбция фага и одностадийная кинетика роста

Свойства роста фага определяли по кинетике одностадийного роста и скорости адсорбции фага. Результаты исследования адсорбции

.

Смотрите также

От вздутия живота народные средства

От Вздутия Живота Народные Средства

Народные средства от вздутия живота Вздутие живота или метеоризм характеризуется излишним скоплением газов в кишечнике, которое может вызывать болезненные… Подробнее...
Заболевания вызывающие тошноту, диарею и повышенную температуру тела

Температура Понос Тошнота

Заболевания вызывающие тошноту, диарею и повышенную температуру тела Каждый хоть однажды сталкивался с такими неприятными симптомами, как температура, понос,… Подробнее...
Почему у ребенка зеленый понос

Понос Зеленый У Ребенка

Почему у ребенка зеленый понос Появление у ребенка зеленого поноса часто вводит в панику его родителей. Не зная причину появления поноса зеленого цвета, в… Подробнее...
Какие болезни сопровождаются поносом и рвотой

Температура Понос Рвота У Ребенка

Какие болезни сопровождаются поносом и рвотой У маленького ребенка еще только формируется защитная система организма, и… Подробнее...
Лекарство от вздутия живота

Лекарство От Вздутия Живота

Чем снять вздутие живота Вздутие живота, как его называют врачи, метеоризм, — неприятная, а главное, исключительно… Подробнее...
Причины поноса после еды

После Еды Сразу Иду В Туалет По Большому - Понос

Причины поноса после еды Некоторый жалуются, что после еды сразу идут в туалет по-большому из-за поноса. Такая… Подробнее...
Понос после арбуза

Понос После Арбуза

Какие продукты могут вызвать понос Расстройство пищеварения может возникнуть не только как реакция на отравление, но и… Подробнее...
Первая помощь ребенку при рвоте

Рвота У Ребенка Без Температуры И Поноса Что Делать - 3 Года

Первая помощь ребенку при рвоте Дети до 5 лет являются самой восприимчивой к различным вирусам и бактериям группой.… Подробнее...

Информация, размещенная на сайте, не может рассматриваться как рекомендация пациентам по диагностированию и лечению каких-либо заболеваний и не может служить заменой консультации с врачом. Ничто в данной информации не должно быть истолковано как призыв неспециалистам самостоятельно лечить диагностированные заболевания. Данная информация не может быть использована для принятия решения об изменении порядка и режима применения продуктов, рекомендованного врачом.


Copyright medrox.ru © 2015- Карта сайта, XML.